Evaluación del desarrollo y la eficacia de desinfectantes para manos y películas de ácido poliláctico que incorporan ácido cafeico y vainillina para mejorar las propiedades antivirales contra el HCoV

Revista de Virología volumen 20, Número de artículo: 194 (2023) Citar este artículo

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Aunque tres años después del brote del SARS-CoV-2, el virus sigue teniendo un impacto significativo en la salud humana y la economía global. La infección a través de gotitas respiratorias es la principal vía de transmisión, pero no se puede ignorar la transmisión del virus por contacto superficial. Se pueden aplicar desinfectantes para manos y películas antivirales para controlar el SARS-CoV-2, pero los desinfectantes y las películas presentan inconvenientes como la resistencia del virus al etanol y problemas ambientales, incluido el uso excesivo de plásticos. Por lo tanto, este estudio sugirió aplicar sustratos naturales a desinfectantes para manos y películas antivirales hechas de plástico biodegradable (PLA). Se espera que este enfoque proporcione ventajas para el fácil control del SARS-CoV-2 mediante la aplicación de sustancias naturales.

Se fabricaron películas y desinfectantes antivirales añadiendo ácido cafeico y vainillina a etanol, alcohol isopropílico, cloruro de benzalconio y PLA. Las eficacias antivirales se evaluaron con métodos de prueba estándar internacionales ligeramente modificados EN 14.476 e ISO 21.702.

En suspensión, todos los desinfectantes para manos evaluados en este estudio mostraron una reducción de más de 4 log en 2 minutos contra HCoV-229E. Después de agregar sustancias naturales a los desinfectantes para manos, el tiempo necesario para alcanzar el límite de detección del título viral se redujo tanto en suspensión como en piel porcina. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia en el tiempo necesario para alcanzar el límite de detección del título viral en el cloruro de benzalconio. En el caso de las películas antivirales, las fabricadas con PLA y sustancias naturales mostraron una reducción de 1 log de HCoV-229E en comparación con la película de PLA pura para todos los grupos de tratamiento. Además, se evaluó la influencia de la carga orgánica según el número de contactos de los productos antivirales con piel porcina. Diez frotaciones en la piel dieron como resultado una actividad antiviral ligeramente mayor que 50 frotaciones.

Este estudio reveló que el ácido cafeico y la vainillina se pueden utilizar eficazmente para controlar el HCoV-229E en desinfectantes para manos y películas antivirales. Además, se recomienda eliminar la materia orgánica de la piel para mantener la actividad antiviral del desinfectante para manos y la película antiviral, ya que la actividad antiviral disminuyó a medida que aumentó la carga orgánica en este estudio.

El síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) surgió por primera vez en Wuhan, China, en 2019 y se extendió por todo el mundo en un corto período, causando alrededor de 645 millones de infecciones y 6,6 millones de muertes en noviembre de 2022 [1]. El SARS-CoV-2 está clasificado como un nuevo beta-coronavirus de la familia Coronaviridae. El SARS-CoV-2 es un virus envuelto con ARN monocatenario de sentido positivo [2]. Este virus no solo causa síntomas respiratorios como tos, dolor de garganta, dificultad para respirar y secreción nasal, sino que también produce síntomas gastrointestinales como diarrea, vómitos y dolor abdominal [3]. Según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de Estados Unidos, la principal vía de transmisión del SARS-CoV-2 es la exposición de las mucosas a superficies contaminadas a través de las manos o la exposición directa del tracto respiratorio a gotitas que contienen el virus a través del contacto de persona a persona [4]. Por estas razones, la Organización Mundial de la Salud (OMS) y los CDC han enfatizado constantemente la importancia de la higiene de las manos [5] y han solicitado que las superficies de contacto comunes como el acero inoxidable, el plástico y el vidrio, que muestran una alta estabilidad para el SARS-CoV. -2, se mantienen limpios [6, 7]. En particular, los CDC han seleccionado manijas de carritos de compras, botones de ascensores, teclados y grifos como ejemplos de superficies con las que la gente contacta habitualmente [8]. Por ello, se han realizado muchos estudios para prevenir el contagio secundario utilizando una película antiviral como método adicional para desinfectar estas superficies [9].

Actualmente se comercializan y utilizan ampliamente películas antivirales que incorporan cobre y plata [10]. Las propiedades antivirales de estas películas podrían reforzarse añadiendo ingredientes como extracto de té y aceites esenciales [11]. Se han realizado investigaciones adicionales para minimizar la exposición de las personas a las partículas de virus y evitar que estas partículas se depositen en la superficie mediante la aplicación de propiedades físicas como la superhidrofobicidad [10]. Por lo tanto, se seleccionó PLA porque puede conjugarse con otros materiales e inhibir la adhesión de un virus a una superficie mediante hidrofobicidad [12]. Además, el PLA se puede utilizar en diversos campos, como la medicina, el embalaje, la electrónica, los automóviles y los textiles, debido a sus excelentes características que incluyen el respeto al medio ambiente, la biodegradabilidad, la biocompatibilidad y la hidrofobicidad [12].

La eficacia de los desinfectantes para manos se ha evaluado desde el brote de SARS-CoV-2. La investigación realizada por Herdt y colaboradores [13] indica una reducción superior a 4 log durante 30 s de tratamiento con etanol y desinfectantes para manos a base de amonio cuaternario. Además, también se realizaron investigaciones para evaluar la actividad antiviral ajustando la proporción de desinfectantes [14] o agregando sustancias naturales con efectos antivirales a las formulaciones existentes para aumentar el poder virucida [15, 16]. Las sustancias naturales han proporcionado excelentes alternativas de tratamiento para diversas enfermedades infecciosas desde la antigüedad [17]. En particular, los fitoquímicos como los flavonoides, alcaloides y polifenoles, que se encuentran principalmente en las plantas, brindan beneficios a los humanos [18]. Además, los fitoquímicos muestran actividad antimicrobiana [19], especialmente los alcaloides, terpenos, flavonoides y glucósidos muestran una fuerte actividad antiviral contra la influenza, el dengue, la polio y los adenovirus altamente patógenos [20].

El ácido cafeico es un polifenol contenido en el café, las bayas y el té [R]. El ácido cafeico muestra actividades biológicas que incluyen efectos antiinflamatorios, anticancerígenos y de mejora del sistema inmunológico [22, 23], y puede desempeñar un papel como sustancia antiviral. Varios estudios han informado que el ácido cafeico es eficaz contra el virus que causa el síndrome de trombocitopenia febril grave, ya que inhibe la unión del virus a una célula huésped e interrumpe la replicación del ARN viral del herpes simple y el virus de la influenza A [24,25 ,26]. Se considera que los mecanismos antivirales del ácido cafeico contra el SARS-CoV-2 se deben a que se dirige a las estructuras del virus, la proteína de pico, la proteína no estructurada y la proteasa principal [21]. Aunque el mecanismo antiviral no se ha identificado claramente, un estudio [27] mencionó que el ácido cafeico se une al dominio A5 de la proteína de choque térmico de la superficie celular, utilizando una alta afinidad de unión, que funciona como el mecanismo detrás del SARS-CoV-2. reconocimiento del huésped, suprimiendo así la unión entre el huésped y el virus. Además, otros estudios [28, 29] mencionaron que el ácido cafeico puede unirse a la proteasa principal y a la proteína no estructurada, que son esenciales para la madurez y replicación del virus, inhibiendo así el proceso proteolítico y reduciendo la actividad enzimática por acción competitiva. inhibición, lo que a su vez reduce la posibilidad de transmisión del SARS-CoV-2.

La vainillina es un aldehído fenólico aislado de la vaina de vainilla y se utiliza principalmente en sustancias aromáticas, aditivos alimentarios, perfumes y productos farmacéuticos [30]. Recientemente, se han publicado varios estudios sobre los beneficios para la salud de la vainillina, incluidos los efectos anticancerígenos, antioxidantes, antiinflamatorios [31,32,33] y antivirales [34]. Los estudios [35, 36] han demostrado la eficacia de la vainillina contra el virus del herpes simple tipos 1 y 2 y el virus H1N1. Se logró una reducción del 60% del efecto citopático utilizando 500 ppm de extracto de M. officinalis, mientras que se logró una reducción del 85% del efecto citopático utilizando 125 ppm de vainillina. Al igual que el ácido cafeico, no se ha identificado el mecanismo exacto detrás de la acción de la vainillina, pero la vainillina se dirige a la proteasa principal y a la proteína de pico del SARS-CoV-2 [21]. La vainillina puede mantener un estado de unión estable a la proteína del SARS-CoV-2 a través de van der Waals, enlaces de hidrógeno y enlaces hidrófobos, que pueden reducir la infectividad del huésped mediante la conexión competitiva entre el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 y enzima convertidora de angiotensina 2 en la proteína de pico [34, 37]. Además, esta puede ser una forma de inhibir la traducción de poliproteínas virales y la actividad replicasa en la proteasa principal [38].

Los desinfectantes para manos y las películas antivirales se consideran estrategias eficaces para reducir la propagación del SARS-CoV-2. Sin embargo, su actividad antiviral podría verse limitada en entornos donde existen sustancias orgánicas y virus de envoltura [39]. Además, debido a la aplicación continua de desinfectantes para manos o películas antivirales, los patógenos desarrollan resistencia a los principios activos, lo que supone un problema grave [40]. Un estudio reciente que comparó la viabilidad de las cepas Omicron y Wuhan en plástico y piel mostró que la viabilidad de Omicron era más del doble que la de Wuhan, y se necesitaba una concentración de etanol un 7% mayor en experimentos con desinfectantes para lograr la misma inactivación en comparación con las cepas Omicron y Wuhan en plástico y piel. Cepa de Wuhan [41]. Por lo tanto, es necesario desarrollar desinfectantes para manos y películas antivirales seguros y eficaces que puedan crear efectos sinérgicos para inactivar el SARS-CoV-2.

El objetivo principal de este estudio fue evaluar el efecto antiviral del ácido cafeico y la vainillina como sustancias naturales contra el HCoV-229E, un sustituto del SARS-CoV-2. Se fabricaron nuevos desinfectantes para manos y películas de PLA que contenían vainillina y ácido cafeico para evaluar sus propiedades antivirales. Los efectos antivirales de los desinfectantes para manos y las películas antivirales de PLA recientemente formulados se evaluaron utilizando un modelo de piel porcina como sustituto de la piel humana.

Se adquirieron células MRC-5 de fibroblastos de pulmón humano (cepa celular 5 del Medical Research Council) de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; Rockville, MD, EE. UU.). Las células MRC-5 se cultivaron utilizando medio esencial mínimo de Eagle (MEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) mezclado con suero fetal bovino al 10 % (FBS; Gibco, Rockville, MD, EE. UU.) y penicilina-estreptomicina al 1 %. (Gibco). Las células se cultivaron en un matraz de cultivo de 75 cm2 y se incubaron a 37 ℃ con 5% de CO2. Si la densidad de las células era casi del 100% bajo el microscopio, se procedía al subcultivo. Primero, el medio de cultivo celular se descartó y se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS; Sigma-Aldrich). Luego, se aspiró la solución de PBS y se añadió suavemente 1 ml de tripsina-EDTA (1X) (Gibco) al 0,25% para separar las células del fondo del matraz. Después de 6 a 10 minutos de incubación a 37 ℃ con 5% de CO2, las células se centrifugaron a 300 xg durante 5 minutos. El sedimento celular se mezcló suavemente con 1 ml de medio de cultivo celular nuevo y se transfirió a un matraz nuevo. Todos estos procedimientos se realizaron cada 2 a 4 días.

El coronavirus humano 229E (HCoV-229E) se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; Rockville, MD, EUA) para usarlo como sustituto del SARS-CoV-2. Cuando la densidad de las células era casi del 90 al 100% bajo un microscopio, el medio de cultivo celular se desechó y se lavó con DPBS dos veces. Después de aspirar DPBS, se calculó la cantidad exacta de suspensión de HCoV-229E con MOI (multiplicidad de infección) = 0,1 y se inyectó suavemente el virus en el matraz de cultivo celular. Luego, el matraz se colocó en una incubadora con 5% de CO2 a 33 ℃ durante 2 h para asegurar la adhesión del virus. Durante este tiempo, se sacó el matraz de la incubadora y se agitó suavemente cada 30 min. Al final de estos procedimientos, se preparó el medio de mantenimiento (MEM con 1% de FBS) y se añadió hasta alcanzar 10 ml de volumen total. El CPE (efecto citopático) se observó durante 3 a 7 días, y si se confirmaba el CPE, la muestra se almacenaba en el congelador para realizar tres ciclos de congelación-descongelación. Todas las suspensiones del virus HCoV-229E se recogieron en 50 ml de un tubo cónico y se centrifugaron a 4000 xg y 4 ℃ durante 10 min. Finalmente, el sobrenadante se filtró con un filtro de jeringa de 0,2 μm para eliminar el sedimento celular y se almacenó en un congelador a -80 ℃ antes de su uso en los experimentos.

Se realizó el ensayo MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio] para determinar la viabilidad celular, utilizando ácido cafeico y vainillina. Se sembraron células MRC-5 con una densidad de 1 x 104 células/100 µL en una placa de 96 pocillos, y después de 24 h, se eliminó el medio antiguo y se reemplazó con medio de cultivo celular nuevo mezclado con varias concentraciones (30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 µmol) de sustancias naturales. El reactivo MTT se añadió cada 3 h antes de cada experimento, se agitó suavemente durante 15 minutos y se incubó a 37 ℃ con 5 % de CO2 para generar formazán. Después de retirar la placa de pocillos en el momento experimental exacto, se retiró el medio, se añadieron 100 µl de DMSO a cada pocillo y el formazán se disolvió pipeteando a una velocidad adecuada. La medición de la densidad óptica se realizó utilizando un espectrofotómetro (Spectra Max 190, Sunnyvale, EE. UU.) a 460 nm. El porcentaje de viabilidad celular se calculó utilizando la siguiente fórmula:

Viabilidad celular (%) = [Valor numérico de DO – Valor en blanco / Valor de DO de control – Valor en blanco] × 100.

Se compraron un producto a base de etanol al 70% (AMOREPACIFIC CO., LTD, Seúl, Corea) y un producto a base de alcohol isopropílico al 70% (Green Pharmaceutical., LTD, Seúl, Corea). Se adquirió un producto a base de cloruro de benzalconio al 10 % (Green Pharmaceutical., LTD) y se diluyó hasta una concentración del 0,066 %.

Todos estos desinfectantes para manos se probaron para determinar la actividad virucida contra HCoV-229E como sustituto del SARS-CoV-2, utilizando un protocolo ligeramente modificado de la norma europea EN14476 para cuantificar el valor de reducción en suspensión. Primero, el desinfectante de manos comercial se agitó durante 30 segundos y se transfirió una alícuota de 800 µl a un tubo EP de 1,5 ml. Luego, se agregaron lentamente 100 µl de albúmina sérica bovina (BSA) de 0,3 g/l a 100 µl de suspensión de virus para ajustar el volumen final a 1 ml, y la mezcla se trató con desinfectante para manos durante 0,5, 1, 2, 3. y 5 min. Durante este tiempo de tratamiento, las soluciones se mezclaron vigorosamente mediante pipeteo. Cuando se completó cada tiempo de tratamiento, se tomó una alícuota de 100 µL y se mezcló con 900 µL de MEM + 1% FBS para neutralizar las sustancias de prueba. Finalmente se realizó una dilución seriada y se inoculó el virus para calcular el título viral.

Los desinfectantes para manos formulados se prepararon aplicando protocolos de desinfectantes para manos caseros de la OMS ligeramente modificados (Tabla 1). Alcohol (99,9%) (DAEJUNG CO., LTD, Siheung, Corea), alcohol isopropílico (99,5%) (JUNSEI CO., LTD, Japón) y cloruro de benzalconio (10%) (Green Pharmaceutical., LTD, Seúl, Corea ) se compraron y se mezclaron directamente con glicerol, propilenglicol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU., reactivo ACS, 99,5%) y agua destilada esterilizada en autoclave. El pH de los tres desinfectantes para manos se ajustó añadiendo 1 M de hidróxido de sodio y 1 N de ácido clorhídrico. Finalmente, todos los desinfectantes para manos se filtraron a través de un filtro de 0,22 μm instalado en un sistema de botella de almacenamiento de 250 ml para evitar la contaminación y eliminar los residuos.

Como sustancias antivirales se utilizaron ácido cafeico (Sigma-Aldrich, 98,0% HPLC) y vainillina (Sigma-Aldrich, ReagentPlus®, 99%). Se usó etanol (100 ml) como disolvente. Se disolvieron ácido cafeico (108,1 mg) y vainillina (152,15 mg) en etanol para preparar soluciones de 6.000 y 10.000 µmol/ml. Finalmente, se añadió 1 ml de la solución preparada al desinfectante de manos formulado para ajustar el volumen total a 100 ml. El método experimental es el mismo que se menciona en la preparación de desinfectante para manos comercial.

Se compró piel de cerdo fresca en un mercado local en Anseong, Corea. La piel porcina se lavó dos veces con agua del grifo y agua destilada. Luego se secó ligeramente la piel del cerdo y se cortó en cuadrados de 2 × 2 cm con un cuchillo esterilizado. Posteriormente, colocamos los trozos de piel porcina en placas de Petri estériles y los irradiamos con luz ultravioleta durante 15 minutos en los lados epidérmico y dérmico.

Las muestras se transfirieron a una placa de 6 pocillos para una inoculación suave. Se inoculó por puntos una suspensión del virus HCoV-229E (100 µl, 7,0 log TCID50/ml) en el lado epidérmico y la suspensión se extendió usando una punta de pipeta para la adhesión del virus. Después de 30 minutos de incubación, se aplicaron 800 µl del desinfectante para manos formulado y 100 µl de BSA a cada muestra para ajustar el volumen total a 1 ml. Cada tratamiento se realizó durante 0,5, 1, 2, 3 y 5 minutos y las muestras se sacaron inmediatamente para remojarlas en 2 ml de solución de FBS + MEM al 1 % para neutralizar el desinfectante de manos. El virus se recuperó agitando durante 1 min. Finalmente, la muestra se filtró utilizando un filtro de jeringa de 0,2 μm y la suspensión recuperada se inoculó para medir el título viral.

Como sustancia de recubrimiento primario se utilizó ácido poliláctico (PLA) (Goodfellow., LTD, Inglaterra). Se utilizó cloroformo (Sigma Aldrich, 99,5%) como disolvente ya que produjo la mayor solubilidad. Se colocó una barra magnética en un vaso de precipitados de 500 ml, se cubrió con papel de aluminio y se esterilizó en autoclave a 121 ℃ durante 15 min. Los gránulos de PLA se mezclaron con cloroformo durante 1 a 2 h para alcanzar una concentración del 7,6 % (p/v). La mezcla se detuvo cuando se confirmó visualmente que las partículas de PLA estaban completamente derretidas.

Se utilizaron ácido cafeico y vainillina como sustancias antivirales. Se disolvieron ácido cafeico (108,1 mg) y vainillina (152,15 mg) en 10 ml de etanol para preparar soluciones de 6.000 y 10.000 µmol/ml. Posteriormente, se realizó una dilución seriada para preparar las correspondientes soluciones de 600 y 1000 µmol/mL. Finalmente, se mezclaron 10 ml de esta solución con 90 ml de la solución de recubrimiento de PLA para ajustar el volumen total a 100 ml, se agitaron vigorosamente durante 1 a 2 h y se vertieron 10 ml en marcos cuadrados de acero inoxidable. Las muestras se secaron entre 50 y 60 ℃ durante 2 a 3 días para alcanzar propiedades termodinámicas.

La eficacia de la película antiviral se evaluó utilizando el método de Butot y colaboradores [9], con ligeras modificaciones basadas en la norma ISO 21.702 para medir los efectos antivirales en superficies plásticas y no porosas. El recubrimiento se cortó en cuadrados de 2 × 2 con tijeras esterilizadas y se sumergió en etanol al 70% durante 5 minutos para eliminar los residuos. Luego, se colocó papel de filtro Whatman No. 4 en una placa de Petri, se colocaron tres películas una encima de la otra y las películas se secaron de un lado a otro durante 15 minutos. Posteriormente, se inocularon 25 µL de suspensión del virus HCoV-229E en cada recubrimiento y se secaron durante 30 minutos para asegurar la adhesión del virus. Luego, se probaron muestras de película de PLA puro (NP), 60 µmol de ácido cafeico añadido (CP) y 100 µmol de vainillina añadido PLA (VP) contra HCoV-229E durante 2 h a intervalos de 30 min.

Tan pronto como terminó cada tiempo de procesamiento, las muestras se empaparon en 1 ml de solución de FBS + MEM al 1 % y el virus se recuperó mediante agitación vorticial durante 1 min. Finalmente, se inoculó la suspensión recuperada para medir el título viral.

Los métodos para preparar las muestras de piel y película porcina fueron los mismos que en la evaluación de la eficacia del desinfectante para manos en piel porcina y la película antiviral de PLA contra la suspensión de HCoV-229E, respectivamente. Después de colocar cada una de las tres películas antivirales y muestras de piel porcina en una placa de Petri, se inocularon 25 µL de suspensión de HCoV-229E en la capa de epidermis de la piel. Luego, la epidermis inoculada con el virus se recogió cuidadosamente con unas pinzas esterilizadas y se frotó con cada película preparada 10 y 50 veces a intervalos de 30 min durante 2 h. Aquí, 50 frotaciones representan el número máximo de contactos promedio diario en superficies muy tocadas, y 10 frotaciones representan una frecuencia de contacto baja.

Una vez completado el número de frotaciones (cada 30 minutos), la muestra se empapó inmediatamente en 1 ml de solución de FBS + MEM al 1 % y luego se recuperó el virus mediante agitación vorticial durante 1 minuto. Finalmente, la muestra se filtró con un filtro de jeringa de 0,2 μm y la suspensión recuperada se inoculó para medir el título viral.

Se realizó un análisis ATR-FTIR para verificar la conjugación de las películas antivirales recubiertas de vainillina (VP) y ácido cafeico (CP) en las superficies de PLA. Las superficies se prepararon de la misma manera que se mencionó en la preparación de una película antiviral utilizando PLA y sustancias naturales. Los espectros se midieron utilizando un espectrómetro FT-IR Nicolet iS10 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) entre longitudes de onda de 4000 y 400 cm-1 sin preparación adicional de la muestra. Se analizaron diferentes muestras recubiertas en cinco puntos aleatorios con 0,5 cm − 1 de resolución pico a pico por espectro. Para cada espectro, se combinaron 32 exploraciones con una resolución de pico a pico de 4 cm-1. Después del tratamiento, los datos se registraron mediante un software FT-IR de alto rendimiento de 64 bits. Los datos documentados se alinearon y los números de onda de los espectros principales se detectaron mediante el software OMNIC™ Spectra (Thermo Fisher Scientific) en modo de transmisión (%T) [42].

En todos los experimentos, el título de HCoV-229E se calculó utilizando el ensayo de dosis infecciosa en cultivo de tejidos. Brevemente, se sembraron células MRC-5 con una densidad de 1 x 104 células/100 µl en una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37 ℃ con 5% de CO2 hasta que se observó una densidad del 50% bajo un microscopio. Después de 24 h, se descartó el medio de cultivo celular y se lavó con DPBS una vez. La muestra de virus se preparó con una dilución en serie de 10 veces, usando FBS al 1% de medio de cultivo celular MEM, y se inoculó. La placa de 96 pocillos inoculada se incubó a 33 ℃ con 5 % de CO2 durante 5 días para determinar el CPE con un microscopio. El CPE se calculó utilizando el método de Reed-Muench (también conocido como diferencia de logaritmos):

Diferencia de logaritmos = [(mortalidad en una dilución justo por encima del 50%)-50%] / [(mortalidad justo por encima del 50%) -(mortalidad justo por debajo del 50%)]

Los experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado, utilizando al menos tres muestras. Las expresiones del título viral se calcularon como funciones logarítmicas (log TCID50/mL en suspensión y piel porcina). Todos los datos se expresaron como media ± desviación estándar (DE). Se utilizó IBM SPSS Statistics versión 26 (IBM Corp, Armonk, NY, EE. UU.) para realizar la prueba de rango múltiple de Duncan y el análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Los gráficos se prepararon utilizando Sigma-Plot versión 10.0 (Systat Software, Inc., San José, CA, EE. UU.). Se determinaron diferencias significativas entre el tiempo de tratamiento del desinfectante para manos y la película usando p <0,05.

La Figura 1 muestra la eficacia de los desinfectantes para manos comerciales a base de etanol, alcohol isopropílico y cloruro de benzalconio contra el HCoV-229E en suspensión. El título inicial de HCoV-229E fue de 6,1 log TCID50/ml. El desinfectante comercial de etanol al 70 % mostró valores de reducción logarítmica de HCoV-229E de 2,5, 3,0, 4,6 y 5,0 log10 TCID50/mL durante 0,5, 1, 2 y 3 minutos de tratamiento, y ningún CPE (límite de detección: 0,5 log TCID50/ mL) se observó a los 5 min de tratamiento, respectivamente.

Inactivación de HCoV-229E en suspensión mediante desinfectantes para manos comerciales. Las barras de error representan las desviaciones estándar de las medias (DE). Los EA indican diferencias significativas (p < 0,05) según el tiempo de tratamiento. La línea discontinua corta indica el límite de detección (0,5 log TCID50/mL)

El desinfectante con alcohol isopropílico al 70 % mostró valores de reducción logarítmica de 4,5, 4,7 y 5,5 durante 0,5, 1 y 2 minutos, y no se observó CPE (límite de detección: 0,5 log TCID50/ml) después de 3 minutos de tratamiento.

El producto a base de cloruro de benzalconio diluido a una concentración del 0,066 % mostró valores de reducción logarítmica de 3,6, 3,7, 4,0 y 4,4 durante 0,5, 1, 2 y 3 minutos, y no se observó CPE (límite de detección: 0,5 log TCID50/ mL) después de 5 min de tratamiento.

La Figura 2 muestra la eficacia de los desinfectantes para manos formulados a base de etanol, alcohol isopropílico y cloruro de benzalconio contra el HCoV-229E en suspensión. El título inicial de HCoV-229E fue de 6,5 log TCID50/ml. El desinfectante de manos formulado con etanol al 70 % mostró valores de reducción logarítmica de HCoV-229E de 3,2, 3,8, 4,6 y 5,5 log TCID50/ml durante 0,5, 1, 2 y 3 minutos y ningún CPE (límite de detección: 0,5 log TCID50/ml). se observó después de 5 minutos de tratamiento, respectivamente. El producto de alcohol isopropílico al 70 % exhibió valores de reducción logarítmica de 4,8, 5,1, 5,7 y 5,8 durante 0,5, 1, 2 y 3 minutos, y no se observó CPE (límite de detección: 0,5 log TCID50/ml) después de 5 minutos de tratamiento. .

Inactivación de HCoV-229E en suspensión mediante desinfectantes para manos formulados. La barra de error representa las desviaciones estándar de las medias (DE). Los EA indican diferencias significativas (p <0,05) de cada desinfectante de manos por tiempo de tratamiento. La línea discontinua corta informa el límite de detección (0,5 log TCID50/ml)

Los productos formulados de cloruro de benzalconio diluidos a una concentración del 0,066% mostraron valores de reducción logarítmica de 3,1, 4,4, 4,8 y 5,1 durante 0,5, 1, 2 y 3 minutos, y el resultado del grupo de tratamiento de 5 minutos fue el mismo que el del grupo de tratamiento de 5 minutos. los dos desinfectantes anteriores. (límite de detección: 0,5 log TCID50/mL)

Se realizó un ensayo MTT para determinar la concentración óptima de ácido cafeico y vainillina que puede proporcionar actividad antiviral sin mostrar efectos citotóxicos. La Figura 3 muestra que el ácido cafeico y la vainillina reprimen la proliferación de células MRC-5 en concentraciones superiores a 60 µmol y 100 µmol, respectivamente, durante 5 días de tratamiento. Cuando se aplicaron ácido cafeico y vainillina a 60 µmol y 100 µmol durante 5 días, la viabilidad de las células MRC-5 se mantuvo por encima del 80%.

Citotoxicidad de MRC-5 en diversas concentraciones por ácido cafeico (A) y vainillina (B) La línea discontinua corta informa el 80% de la viabilidad celular en cada concentración de ácido cafeico y vainillina

La Figura 4 A, B y C muestra la eficacia de las sustancias naturales agregadas a los desinfectantes para manos formulados contra el HCoV-229E en suspensión. El título inicial de HCoV-229E fue de 6,5 log TCID50/ml.

Comparación de la eficacia de los desinfectantes para manos formulados que contienen sustancias naturales frente a la suspensión. (A), (B) y (C) representan etanol, alcohol isopropílico y cloruro de benzalconio, respectivamente. Las barras de error representan desviaciones estándar de las medias (DE). Los EA indican diferencias significativas (p < 0,05) según el tiempo de tratamiento. La línea discontinua indica el límite de detección (0,5 log TCID50/mL)

El desinfectante de manos formulado con etanol al 70 % mostró valores de reducción logarítmica de HCoV-229E de 3,2, 3,8, 4,6 y 5,5 log TCID50/ml durante 0,5, 1, 2 y 3 minutos y ningún CPE (límite de detección: 0,5 log TCID50/ml). Se observó a los 5 min de tratamiento. El desinfectante elaborado con etanol al 70 % y 60 µmol de ácido cafeico mostró valores de reducción logarítmica de HCoV-229E de 4,0, 4,4 y 5,7 durante 0,5, 1 y 2 minutos de tratamiento, respectivamente, y ningún CPE (límite de detección: 0,5 log TCID50 /mL) se observó después de 3 minutos de tratamiento. El desinfectante de manos formulado con etanol al 70 % con 100 µmol de vainillina mostró valores de reducción logarítmica de HCoV-229E de 3,9, 4,7 y 5,0 log durante 0,5, 1 y 2 minutos de tratamiento, respectivamente, y ningún CPE (límite de detección: 0,5 log TCID50 /mL) se observó después de 3 minutos de tratamiento. El producto formulado con alcohol isopropílico al 70 % mostró valores de reducción logarítmica de 4,8, 5,1, 5,7 y 5,8 durante 0,5, 1, 2 y 3 minutos, y no se observó CPE (límite de detección: 0,5 log TCID50/ml) durante un tratamiento de 5 minutos. . El producto formulado con alcohol isopropílico al 70 % y 60 µmol de ácido cafeico mostró una reducción de 5,7 log durante 0,5 min de tratamiento, y no se observó CPE (límite de detección: 0,5 log TCID50/mL) después de 1 min de tratamiento. El producto formulado con alcohol isopropílico al 70 % y 100 µmol de vainillina mostró un valor de reducción logarítmica de 5,6 durante 0,5 min de tratamiento, y no se observó CPE (límite de detección: 0,5 log TCID50/mL) después de 1 min de tratamiento.

El desinfectante de cloruro de benzalconio diluido al 0,066 % mostró valores de reducción logarítmica de 3,1, 4,4, 4,8 y 5,1 durante 0,5, 1, 2 y 3 minutos de tratamiento. El producto formulado con 0,066% de cloruro de benzalconio y 60 µmol de ácido cafeico mostró valores de reducción logarítmica de 4,6, 4,7, 5,1 y 5,7 durante 0,5, 1, 2 y 3 min de tratamiento, respectivamente. El producto formulado con 0,066% de cloruro de benzalconio y 100 µmol de vainillina exhibió valores de reducción logarítmica de 4,5, 4,6, 5,2 y 5,4 durante 0,5, 1, 2 y 3 minutos de tratamiento, respectivamente.

Todos los desinfectantes para manos formulados a base de cloruro de benzalconio que contienen sustancias naturales no mostraron CPE (límite de detección: 0,5 log TCID50/ml) después de 5 minutos de tratamiento.

La Figura 5 A, B y C muestra la eficacia de los desinfectantes para manos formulados que contienen sustancias naturales contra el HCoV-229E en piel porcina.

Comparación de los efectos de las sustancias naturales en los desinfectantes para manos formulados en la piel porcina. (A), (B), (C) representan etanol, alcohol isopropílico y cloruro de benzalconio, respectivamente. Las barras de error representan desviaciones estándar de las medias (DE). Los EA indican diferencias significativas (p < 0,05) según el tiempo de tratamiento. La línea discontinua indica el límite de detección (1,0 log TCID50/mL)

El título inicial de HCoV-229E fue de 7,0 log TCID50/ml y se recuperó 4,8 log TCID50/ml. El producto formulado con etanol al 70 % mostró valores de reducción logarítmica de HCoV-229E de 2,0, 2,5 y 2,8 durante 0,5, 1 y 2 minutos de tratamiento, respectivamente, y se observó una reducción logarítmica de 3,3 después de 3 minutos de tratamiento. El producto formulado con 70% de etanol y 60 µmol de ácido cafeico mostró valores de reducción logarítmica de 2,4, 2,6 y 3,2 durante 0,5, 1 y 2 minutos de tratamiento, respectivamente, y ningún CPE (límite de detección: 1,0 log TCID50/mL). Se observó después de 3 minutos de tratamiento. El desinfectante formulado con etanol al 70% y 100 µmol de vainillina mostró valores de reducción logarítmica de 2,1, 2,5, 3,0 y 3,4 durante 0,5, 1, 2 y 3 minutos de tratamiento, respectivamente, y ningún CPE (límite de detección: 1,0 log TCID50/ mL) se observó después de 5 min de tratamiento.

El producto formulado con alcohol isopropílico al 70% mostró valores de reducción logarítmica de HCoV-229E de 2,1, 2,4 y 3,0 durante 0,5, 1 y 2 minutos de tratamiento, respectivamente, y se observó una reducción logarítmica de 3,3 después de 3 minutos de tratamiento (límite de detección: 1,0). log DICT50/mL). El desinfectante formulado con 70 % de alcohol isopropílico y 60 µmol de ácido cafeico mostró valores de reducción logarítmica de 2,6, 2,7 y 3,3 durante 0,5, 1 y 2 minutos de tratamiento, respectivamente, y ningún CPE (límite de detección: 1,0 log TCID50/mL). Se observó después de 3 minutos de tratamiento. El desinfectante formulado con alcohol isopropílico al 70% y 100 µmol de vainillina mostró valores de reducción logarítmica de 2,5, 2,7, 3,0 y 3,5 durante 0,5, 1, 2 y 3 minutos de tratamiento, respectivamente, y ningún CPE (límite de detección: 1,0 log TCID50). /mL) se observó después de 5 minutos de tratamiento.

El producto de cloruro de benzalconio al 0,066 % mostró valores de reducción logarítmica en piel porcina de 2,0, 2,2, 2,6, 3,1 y 3,1 durante 0,5, 1, 2, 3 y 5 minutos de tratamiento, respectivamente (límite de detección: 1,0 log TCID50/ml). El desinfectante a base de cloruro de benzalconio al 0,066% con 60 µmol de ácido cafeico mostró valores de reducción logarítmica de 2,1, 2,5, 2,8, 3,1 y 3,3 durante 0,5, 1, 2, 3 y 5 minutos de tratamiento, respectivamente (límite de detección: 1,0 log DICT50/mL). El desinfectante a base de cloruro de benzalconio al 0,066 % con 100 µmol de vainillina mostró valores de reducción logarítmica de 2,0, 2,3, 2,7, 3,1 y 3,2 durante 0,5, 1, 2, 3 y 5 minutos de tratamiento, respectivamente (límite de detección: 1,0 log TCID50 /ml).

Las películas de PLA recubiertas con vainillina (VP) y ácido cafeico (CP) se analizaron mediante ATR-FTIR y se compararon con las sustancias puras. Se utilizó una biblioteca de referencia verificada informada por estudios previos para la comparación de datos y los datos se resumen en la Tabla 2. El PLA exhibió tres grupos funcionales distintos, identificados como regiones cristalinas carboxílicas, fenólicas y amorfas en forma pura, ubicadas en 1748,7 y 1180,4, 1130. –1041,3 y 868,6–753,9 cm-1 (Fig. 6A). Después del recubrimiento de vainillina en la superficie de PLA, se encontró el grupo carboxílico idéntico de PLA en 1747,93 cm-1. Los enlaces de estiramiento –C = O se observaron en la película recubierta, que exhibió espectros similares a los de la vainillina pura. Además, se observaron interacciones conjugadas a 1586-1509,4 cm-1. Sin embargo, no se detectó la forma pura de vainillina en la superficie recubierta. Además, se detectaron estiramientos de hidroxilo y deformaciones relacionadas en la misma posición que en el espectro de vainillina (3186,2 cm-1) (Fig. 6A). Después de recubrir PLA con ácido cafeico, se detectaron grupos carboxilo similares a los del PLA (Tabla 2; Fig. 6B). Se encontraron interacciones conjugadas en 1590,1, 1454,3, 1429,4, 1298,8, 1265,5 y 1126,7 cm-1. Al igual que en el PLA, también se detectaron grupos carboxílicos (1747,7 cm-1) y fenólicos (1180,2 cm-1). Además, el estiramiento de hidroxilo y las deformaciones fenólicas/carboxílicas fueron las mismas que en el ácido cafeico puro (3185,5 y 860,7 cm-1, respectivamente) (Fig. 6B).

Análisis ATR-FTIR de (A) películas de PLA recubiertas de vainillina y (B) películas recubiertas de ácido cafeico. Cada alfabeto representa (a) vainillina pura y ácido cafeico puro, (b) película de PLA y (c) película de PLA recubierta de vainillina y película de PLA de ácido cafeico. Diferentes números (1?5) indican los grupos funcionales hidroxilo, carboxilo, interacción conjugada, fenólica, amorfa y fenólico/carboxílico.

La Figura 7 muestra la eficacia del PLA y las sustancias naturales agregadas a las películas de PLA contra la suspensión de HCoV-229E. El título inicial de HCoV-229E fue de 5,3 log TCID50/mL, y se recuperaron 4,3, 3,3 y 3,5 log TCID50/mL 0 min después del proceso de secado en cada película de PLA.

Comparación de la eficacia de las películas de PLA añadidas de PLA puro (NP) y sustancias naturales (CP, VP) frente a la suspensión. La barra de error representa la desviación estándar de las medias (SD). Los AD indican diferencias significativas (p<0,05) de cada película antiviral según el tiempo de tratamiento. ac indica una diferencia significativa entre NP y VP, CP en cada grupo de tiempo de tratamiento. (p<0,05) La línea discontinua corta informa el límite de detección (1,0 log TCID50/ml)

En la película de PLA pura (NP), el título de HCoV-229E fue de 4,2, 4,0, 3,6 y 3,3 log durante 30, 60, 90 y 120 minutos de tratamiento, respectivamente (límite de detección: 1,0 log TCID50/ml). En comparación con el NP como grupo de control, el CP mostró valores de reducción logarítmica de 1,2, 1,2, 1,0 y 1,0 log durante 30, 60, 90 y 120 min de tratamiento, respectivamente (límite de detección: 1,0 log TCID50/mL).

La VP mostró valores de reducción logarítmica de 0,9, 1,0, 0,9 y 0,7 durante 30, 60, 90 y 120 min de tratamiento, respectivamente (límite de detección: 1,0 log TCID50/mL).

Se utilizó piel porcina como modelo sustituto de la piel humana para investigar las propiedades antivirales de la película de PLA en función de la presencia de sustancias naturales y el número de contactos entre la película y la piel. Además, se consideraron las condiciones de fricción y pérdida de virus debido a la frecuencia de contacto con la superficie.

Los resultados de la fricción y la pérdida de virus debido a 10 veces de contacto con la superficie se muestran en la Fig. 8A. En la película de PLA pura, el título viral disminuyó a medida que aumentaba el número de frotaciones y el tiempo. El título viral inicial fue de 6,1 log TCID50/ml y, a los 0 minutos, se recuperaron 4,2 log TCID50/ml del virus después de 10 frotaciones. Después de 10 frotaciones sobre piel porcina, los títulos virales mostraron valores de 3,6, 3,1, 2,8 y 2,4 log durante 30, 60, 90 y 120 min de tratamiento, respectivamente.

Comparación de efectos antivirales según el número de contactos sobre piel porcina. (A) y (B) representan la eficiencia de la película de PLA pura, con ácido cafeico y vainillina añadida por tiempos de contacto en piel porcina, respectivamente. Las barras de error representan desviaciones estándar de las medias (DE). Los EA indican diferencias significativas (p<0,05) de cada película antiviral según el tiempo de tratamiento. ac indica una diferencia significativa entre NP y CP, VP en cada grupo de tiempo de tratamiento. (p<0,05) La línea discontinua corta informa el límite de detección (1,0 log TCID50/ml)

Las películas antivirales con sustancias naturales mostraron diferencias significativas en eficiencia en comparación con la mayoría del grupo NP y los grupos de tiempo de tratamiento cuando se contactaron 10 veces. En CP, el título viral inicial fue de 6,1 log TCID50/mL y, a los 0 min, se recuperaron 3,4 log TCID50/mL del virus después de 10 frotaciones. La eficacia de las películas preparadas se comparó con la del NP como control. Cuando cada muestra se frotó 10 veces con CP, el título viral mostró reducciones logarítmicas de 0,3, 0,6, 0,8 y 1,1 durante 30, 60, 90 y 120 minutos de tratamiento, respectivamente. Asimismo, VP mostró la misma tendencia antiviral que CP. El título viral inicial fue de 6,1 log TCID50/ml y, a los 0 minutos, se recuperaron 3,7 log TCID50/ml del virus después de 10 frotaciones. La eficacia de las películas preparadas se comparó con la de NP como control. Cuando cada muestra se frotó 10 veces con VP, las reducciones logarítmicas fueron de 0,2, 0,5, 0,6 y 0,9 durante 30, 60, 90 y 120 minutos de tratamiento, respectivamente.

Sin embargo, en comparación con los grupos que se frotaron 10 veces, las películas antivirales de PLA que contienen sustancias naturales mostraron un efecto relativamente bajo sobre el título viral en los grupos que se frotaron 50 veces. La eficacia de las películas de PLA que contienen 50 frotamientos contra la suspensión de HCoV-229E se muestra en la Fig. 8B. En el NP, el título viral inicial fue de 6,1 log TCID50/mL y, a los 0 minutos, se recuperaron 4,0 log TCID50/mL del virus después de 50 frotaciones. Después de 50 frotaciones sobre piel porcina, los títulos virales mostraron valores de 3,4, 2,7, 2,5 y 2,0 log durante 30, 60, 90 y 120 minutos de tratamiento, respectivamente. En CP y VP, el título viral inicial fue de 6,1 log TCID50/mL y, a los 0 minutos, se recuperaron 3,6 log TCID50/mL del virus después de 50 frotaciones. La eficacia de las películas preparadas se comparó con la de NP como control. Cuando cada muestra se frotó y 50 veces con CP y VP, el título viral mostró reducciones logarítmicas de 0,08, 0,1, 0,4 y 0,3 y 0,04, 0,03, 0,3 y 0,2 durante 30, 60, 90 y 120 min de tratamiento, respectivamente. .

Los desinfectantes de manos comerciales a base de etanol, alcohol isopropílico y cloruro de benzalconio fueron seleccionados según su clasificación de ventas en Corea. Todos los desinfectantes para manos debían cumplir con los estándares de rendimiento de la norma europea (EN) 14.476 de reducción de 4 log en 2 minutos [49]. Así, los desinfectantes comerciales utilizados en este estudio se evaluaron aplicando el protocolo EN 14.476 para cuantificar el valor de reducción logarítmica en suspensión. Los resultados obtenidos mostraron valores superiores a 4 log en 2 min. Estos resultados concuerdan con los experimentos de inactivación contra el SARS-CoV-2, utilizando desinfectantes comerciales a base de alcohol, que han mostrado valores superiores a 3 log en 30 s. Además, los productos comerciales a base de cloruro de isopropilo y benzalconio han mostrado resultados similares contra el SARS-CoV-2 (reducciones superiores a 3 log en 30 s) [13, 50]. Los desinfectantes para manos con etanol, alcohol isopropílico y cloruro de benzalconio formulados en este estudio también se evaluaron aplicando el protocolo EN 14.476. Estos productos redujeron el título viral en más de 4 log en 2 minutos. En particular, el alcohol isopropílico mostró una mayor eficacia para reducir el título viral que el etanol y el cloruro de benzalconio en los grupos de tratamiento de 30 segundos (el título se redujo en 1,5 y 1,6 log, respectivamente). Esto concuerda con un estudio previo [51] que mencionó que el alcohol isopropílico tiene un grupo de carbono más que el etanol en su fórmula molecular, lo que contribuye a la inactivación de las estructuras lipófilas y envueltas del SARS-CoV-2.

Como los desinfectantes para manos se utilizan para limpiar la piel de las manos, se utilizó piel porcina como modelo sustituto de la piel humana para evaluar la eficacia de los desinfectantes para manos. La piel porcina es histológicamente similar a la piel humana y se ha utilizado en varios estudios para evaluar la eficacia de los agentes antimicrobianos. Por lo tanto, se espera que la piel porcina produzca resultados similares a los de la piel humana. En un estudio anterior [52] que evaluó la eficacia de los desinfectantes en la piel porcina, un limpiador para piel y heridas a base de etanol (AWC2) mostró una reducción de 3 log durante 5 minutos de tratamiento después de inocular 6 log UFP/ml de SARS-CoV-2. . Asimismo, el presente estudio mostró una disminución de 3 log cuando la piel fue tratada durante 3 min. Sin embargo, incluso después de 10 minutos de tratamiento con el desinfectante AWC2, la disminución fue inferior a 0,5 log [52]. Además, en el presente estudio no se observaron cambios en el valor de reducción después de 3 minutos. Estos resultados pueden deberse al uso del desinfectante en presencia de materia orgánica como suero o proteínas, lo que dificulta el efecto antiviral [53]. Por lo tanto, las sustancias orgánicas presentes en la piel porcina disminuyeron significativamente (p > 0,05) el poder de desinfección, lo que puede explicar por qué el efecto antiviral de los desinfectantes para manos formulados en este estudio se detuvo después de 3 minutos.

Varias investigaciones se centraron en las importantes propiedades antivirales de los compuestos naturales que tienen principalmente propiedades biológicas y aromáticas de las plantas. Son mezclas complejas de metabolitos secundarios lipófilos y volátiles. Hay varios grupos de antimicrobianos vegetales que incluyen compuestos fenólicos, saponinas, tiosulfinatos, glucosinolatos, terpenoides e isoflavonoides [54]. La mayoría de los estudios antivirales se han centrado en virus con envoltura, mientras que se han realizado investigaciones limitadas sobre la eficacia de estos compuestos naturales contra virus sin envoltura. Por lo tanto, se sabe poco sobre las actividades antivirales de compuestos naturales como aceites esenciales y extractos de plantas contra virus no envueltos. Sin embargo, se sabe que los virus sin envoltura son más resistentes a las condiciones ambientales y a la acción de los antimicrobianos que los virus con envoltura [55]. Varios compuestos naturales pueden inactivar el virus al interferir con la estructura de la envoltura del virión del virus envuelto o por adsorción a la célula huésped, mientras que la cápside proteica del virus sin envoltura protege el ácido nucleico del virus y previene la adsorción del virus. a la célula huésped. Interferir con la entrada puede reducir la eficiencia de la inactivación del virus [56]. descubrió que la aplicación de aceites esenciales no inactivaba eficazmente el norovirus murino y el adenovirus humano, ambos virus sin envoltura, y concluyó que los aceites esenciales no son alternativas para reducir o eliminar los virus sin envoltura en la industria alimentaria. Más recientemente, [57] investigó la actividad antiviral de productos derivados de plantas, incluidos el jugo de chokeberry negro, saúco y granada, así como el té verde, contra el virus vaccinia modificado por sustituto Ankara y el SARS-CoV-2, el virus de la influenza A (IAV ) y adenovirus tipo 5. Aunque su eficacia antiviral varió ya que la composición de cada compuesto natural era diferente, sin embargo, los compuestos naturales probados se redujeron en la mayoría de los virus, excepto el adenovirus tipo 5, que es un virus sin envoltura que era menos susceptible a Los compuestos naturales probados. Sin embargo, también se han encontrado algunos efectos antivirales en virus entéricos pequeños, como el norovirus humano, el norovirus-1 murino, el rotavirus y el adenovirus. Se ha descubierto que tienen algún efecto sobre el virus al actuar hasta cierto punto sobre la cápside proteica. de estos virus [58].

Aunque no se han realizado investigaciones para evaluar la eficacia de los desinfectantes para manos con ácido cafeico y vainillina, se realizó un experimento para determinar el efecto sinérgico de las sustancias naturales y los desinfectantes para manos elaborados con ellas contra el HCoV-229E. Como resultado, los desinfectantes para manos que contenían ácido cafeico y vainillina mostraron un título viral que se redujo al límite de detección, incluso en los experimentos con piel porcina, y el tiempo para alcanzar el límite de detección se redujo para la suspensión viral. En el presente estudio, el tiempo para alcanzar el límite de detección del título del virus en suspensión se redujo de 5 a 3 minutos para el etanol y de 5 minutos a 1 minuto para el alcohol isopropílico después de agregar las sustancias naturales a los desinfectantes para manos. Además, cuando se aplicaron desinfectantes para manos con sustancias naturales a la piel porcina, los productos de etanol y alcohol isopropílico que contenían ácido cafeico inactivaron el HCoV-229E en 3 minutos. Los productos que contenían vainillina inactivaron completamente el virus en 5 minutos. Por el contrario, el cloruro de benzalconio no mostró cambios en el tiempo hasta alcanzar el límite de detección del título del virus, incluso si se añadían sustancias naturales. Informes anteriores [59] y [60] han mencionado que el cloruro de benzalconio mostró una eficacia menor en comparación con los agentes a base de alcohol contra el SARS-CoV-2 y fue más sensible en presencia de materia orgánica en comparación con otros desinfectantes. Sin embargo, el presente estudio mostró suficientes efectos antivirales para este desinfectante ya que la reducción viral fue superior a 4 log en suspensión, lo que concuerda con otros informes [61, 62]. Por tanto, el cloruro de benzalconio también puede considerarse un desinfectante eficaz contra el SARS-CoV-2.

Las películas antivirales, que son algunas de las formas de prevenir la propagación del SARS-CoV-2 a través de las manos, se prepararon mezclando PLA y sustancias naturales. El análisis FTIR confirmó la conjugación de sustancias naturales y PLA. La vainillina y el ácido cafeico se acoplaron fácilmente con las películas de PLA y mostraron enlaces funcionales equivalentes durante el análisis FTIR. Sin embargo, las asignaciones de espectro principal se identificaron como los grupos carboxílicos y fenólicos para las películas de PLA recubiertas con vainillina y ácido cafeico. Estudios anteriores [46,48] informaron resultados similares. El análisis FTIR demostró que sustancias naturales como el ácido cafeico y la vainillina se conjugan con PLA, y la conjugación química o física con estas sustancias naturales mejora las propiedades de las películas de PLA. Por ejemplo, la adición de ácido cafeico al PLA suaviza la película porque el primero actúa como plastificante y también puede proporcionar resistencia a la exposición a los rayos UV y a la intemperie [63, 64]. La vainillina se dispersa molecularmente en un estado amorfo dentro del PLA y aumenta la tasa de biodegradación del PLA, así como el módulo y el alargamiento [65, 66]. Dado que la película antiviral preparada en este estudio fue desarrollada para su uso en la vida real como en un informe anterior [9], la eficacia se evaluó considerando dos condiciones: el alcance de los efectos antivirales durante un corto período de tiempo y la actividad antiviral de las sustancias naturales en presencia de materia orgánica según el número de contactos. En comparación con la película de PLA pura (NP), la película de PLA con ácido cafeico añadido (CP) y la película de PLA con vainillina añadida (VP) mostraron reducciones virales logarítmicas significativas (p <0,05) de 1,0 y 1,2 en 1 h. Un estudio anterior [10] argumentó que las gotas que contienen virus se pueden eliminar mediante propiedades hidrofóbicas (por ejemplo, mediante rebote), lo que mejora el efecto sinérgico de las sustancias antivirales en las superficies hidrofóbicas. Por lo tanto, los efectos antivirales observados de CP y VP pueden deberse al mecanismo propuesto en ese estudio [10]. Además, la diferencia de 1 log a 0 min entre los grupos de películas NP y de sustancias naturales añadidas (CP, VP) puede ser el resultado del secado prolongado (30 min) que probablemente afecte a las películas que contienen sustancias naturales.

Además, para evaluar la eficacia antiviral de sustancias naturales según el número de contactos con piel porcina, se designaron 10 y 50 frotes como contactos intermedios y múltiples, según una metodología reportada [9]. El valor de reducción logarítmica de NP disminuyó a medida que aumentaron el tiempo y el número de frotaciones, lo que concuerda con un estudio previo [67]. Sin embargo, se detectó una diferencia en la tasa de pérdida, que dependía de la presencia de líquido. Aproximadamente entre el 13% y el 16% del virus se desplaza a la superficie del fómite en condiciones húmedas, mientras que sólo alrededor del 3% al 9% se desplaza en condiciones secas. Además, debido a que la fricción generada por el roce puede afectar la transferencia viral, la generación de fricción durante los 50 roces puede resultar en una disminución en el título viral [68]. Tanto CP como VP mostraron una disminución en el título viral durante el tiempo de procesamiento. Sin embargo, a medida que aumentó el número de frotaciones (50 veces), el efecto sobre la reducción viral fue relativamente bajo en comparación con la baja frecuencia del tiempo de contacto (10 veces). Estos resultados pueden explicarse por los factores que afectan la actividad antimicrobiana de las sustancias naturales [69]. Los compuestos fenólicos muestran actividad obstaculizada en presencia de compuestos nitrogenados o grasas y pueden formar complejos con proteínas. Así, las películas que se frotaron 50 veces sobre piel porcina exhibieron una actividad antiviral menor que las sometidas a 10 frotaciones debido a la presencia de materia orgánica en la piel porcina. Sin embargo, en el caso de CP y VP, el título viral casi alcanzó el límite de detección (1 log DICT50/mL) con valores de 1,2 log y 1,5 log después de 2 h de tratamiento. Incluso si se produjeron algunas pérdidas virales debido a la fricción y el contacto, las películas que contienen ácido cafeico y vainillina mostraron suficiente actividad antiviral.

Este estudio investigó la eficacia antiviral de los desinfectantes para manos y las películas de PLA que incorporan sustancias naturales (ácido cafeico y vainillina) contra HCoV-229E, un sustituto del virus SARS-CoV-2. Los desinfectantes para manos vendidos en el mercado y los preparados aquí que incorporan sustancias naturales mostraron una reducción de más de 4 log en 2 min en suspensión. Este estudio también evaluó la eficacia de los desinfectantes para manos preparados en piel porcina contaminada con HCoV-229E. En general, los desinfectantes para manos preparados sin sustancias naturales tendían a tener un poder antiviral ligeramente menor que los que contenían sustancias naturales. Además, al utilizar este último, el título viral alcanzó el límite de detección. El cloruro de benzalconio mostró suficiente actividad antiviral en suspensión y en piel porcina; sin embargo, luego de incorporar sustancias naturales, no hubo diferencia en el tiempo necesario para alcanzar el límite de detección del virus. El análisis FT-IR de películas de PLA que incorporan ácido cafeico y vainillina confirmó que las sustancias naturales y el PLA estaban conjugados. Diez frotaciones con las películas dieron como resultado una actividad antiviral ligeramente mayor que 50 frotaciones. Con base en los resultados obtenidos de este estudio y los informes de la literatura, sugerimos eliminar las sustancias orgánicas presentes en la piel con agua y jabón tanto como sea posible antes de aplicar desinfectantes para manos y películas antivirales. Además, se requieren más investigaciones ya que diversas mutaciones y cepas han aumentado la viabilidad del SARS-CoV-2 en la piel y los fómites, así como su resistencia al etanol. Además, las nuevas alternativas para prevenir la infección por SARS-CoV-2 deberían aprovechar el efecto sinérgico de los desinfectantes con fitoquímicos u otras sustancias antivirales.

No aplica. Todos los datos relevantes están dentro del documento.

Enfermedad del coronavirus 2019

Síndrome Respiratorio Agudo Severo Coronavirus 2

Coronavirus 229E que infecta a los humanos

Ácido polilactico

Análisis de espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier y reflectancia total atenuada

Efecto citopático

Película PLA limpia

Película de PLA con ácido cafeico añadido

Película PLA con vainillina añadida

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Descargar referencias

Esta investigación fue apoyada por las Becas de Investigación de la Universidad Chung-Ang en 2021 y las Becas de Becas de Investigación de la Universidad Chung-Ang en 2022.

Esta investigación fue apoyada por las Becas de Investigación de la Universidad Chung-Ang en 2021 y el Ministerio de Seguridad de Alimentos y Medicamentos en 2022 (subvención n.° 21153MFDS605).

Seok-Woo Hyun y Sangha Han son los coprimeres autores de esta investigación.

Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Grupo de Investigación Avanzada sobre Seguridad Alimentaria, Universidad Chung-Ang, Anseong-si, Gyeonggi-do, 17546, República de Corea

Seok-Woo Hyun, Sangha Han, Jeong Won Son, Min Su Song, Dan Ah Kim y Sang-Do Ha

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Hyun: conceptualización, curación de datos, análisis formal, validación, redacción del borrador original. Han: conceptualización, curación de datos, análisis formal, redacción del borrador original. Hijo: curación de datos, análisis formal, visualización. Kim: curación de datos, investigación. Canción: curación de datos, investigación. Ha - administración, supervisión y financiación del proyecto.

Correspondencia a Sang-Do Ha.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

No aplica.

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Recibido: 30 de abril de 2023

Aceptado: 14 de agosto de 2023

Publicado: 28 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02159-z

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