Los factores salivales de la garrapata Lone Star, Amblyomma americanum, exacerban el resultado clínico de la enfermedad por el virus Heartland en un modelo animal pequeño

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 13304 (2023) Citar este artículo

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El virus Heartland se aisló por primera vez en 2009 de dos pacientes en Missouri y es transmitido por la garrapata Lone Star, Amblyomma americanum. Para comprender la transmisión y patogénesis de enfermedades, es necesario desarrollar un modelo animal que utilice la ruta natural de transmisión y se manifieste de manera similar a los casos humanos documentados. Aquí describimos nuestras investigaciones sobre la identificación de ratones A129 como el modelo animal pequeño más apropiado para la patogénesis de HRTV que imita los resultados clínicos humanos. Investigamos más a fondo el impacto de la saliva de las garrapatas en la mejora de la transmisión de patógenos y los resultados clínicos. Nuestras investigaciones revelaron un aumento en la carga viral en los grupos de ratones que recibieron tanto el virus como el extracto de glándula salival de garrapata (SGE). Los bazos de todos los ratones infectados mostraron hematopoyesis extramedular (EH), pulpa blanca agotada y ausencia de centros germinales. Esta observación imita la esplenomegalia observada en casos humanos naturales. En el grupo que recibió tanto HRTV como SGE por garrapatas, el resultado clínico de la infección por HRTV fue exacerbado en comparación con la infección solo por HRTV. Las puntuaciones de EH y la presencia de antígenos virales en el bazo fueron mayores en ratones que recibieron tanto HRTV como SGE por garrapata. En conclusión, hemos desarrollado un modelo animal pequeño que imita la infección humana natural y también demostramos el impacto de los factores salivales de las garrapatas en la exacerbación de la infección por HRTV.

Las garrapatas han sido un vector conocido de virus que causan enfermedades humanas durante más de un siglo1 y la distribución geográfica de las garrapatas y los patógenos que transmiten se extiende por gran parte del mundo2,3. Aunque los motivos no se comprenden del todo, el número de casos de virus transmitidos por garrapatas está aumentando en las últimas décadas3,4,5,6,7. Desde 2007, los virus transmitidos por garrapatas recientemente descubiertos, incluido el bandavirus Dabie, el agente causante del síndrome de fiebre severa y trombocitopenia (SFTS), el virus Bourbon, el agente causante de la enfermedad por virus Bourbon, y el virus Heartland (HRTV), el agente causante de Heartland enfermedad viral, han sido identificados tanto por casos humanos como por exámenes retrospectivos de suero humano o animal y de garrapatas recolectadas en el campo8,9,10,11. El virus Heartland (familia Phenuiviridae, género Bandavirus) es una enfermedad emergente transmitida por garrapatas, aislada por primera vez en 2009 de dos humanos enfermos en Missouri, EE. UU.9. Tras el descubrimiento inicial de HRTV, se han confirmado más de 50 casos humanos en 14 estados (Fig. 1)12,13. Los síntomas de la enfermedad HRTV son similares a los del SFTSV, estrechamente relacionado, que se aisló en China en 20078, e incluyen fiebre, dolor de cabeza, fatiga, náuseas, dolor muscular y articular, y anorexia, y los análisis de sangre muestran trombocitopenia, leucopenia y enzimas hepáticas elevadas9. ,12,14. Se han conocido cuatro casos mortales de HRTV, todos en personas con comorbilidades sustanciales14,15,16,17. El análisis de sangre recolectada en 2013 de donantes de sangre en el noroeste de Missouri estimó la seroprevalencia humana en áreas endémicas en 0,9%, mientras que las pruebas de individuos con enfermedades de etiología desconocida y síntomas consistentes con la enfermedad HRTV identificaron infección aguda y previa en siete estados18,19. La garrapata Lone Star, Amblyomma americanum, ha sido implicada como vector de HRTV. Los grupos de garrapatas A. americanum recolectadas en el campo capturadas cerca de las casas de los pacientes índice, así como en regiones cercanas de Missouri y Kansas, dieron positivo para HRTV20,21,22,23. Las garrapatas Lone Star son agresivas en la búsqueda de huéspedes y se alimentan fácilmente de humanos24,25,26. El área de distribución actual de A. americanum incluye gran parte del sudeste, noreste y medio oeste de los Estados Unidos, pero los informes de expansión geográfica, así como los modelos de escenarios de cambio climático, indican un aumento de áreas donde las condiciones ambientales son adecuadas para el establecimiento de A. americanum27,28 ,29,30,31. Aunque no se han detectado casos humanos de HRTV en todas las áreas donde está presente A. americanum, la vigilancia limitada de animales salvajes y domésticos en estas áreas ha demostrado seropositividad en múltiples especies, incluido el venado de cola blanca (Odocoileus virginianus), mapaches (Procyon lotor) , coyotes (Canis latrans) y alces (Alces alces) en 18 estados y garrapatas infectadas con HRTV en seis estados (Fig. 1)21,23,32,33,34,35,36,37. Los esfuerzos para desarrollar modelos animales adecuados para estudiar la transmisión y la patogénesis del HRTV han sido limitados y los animales inmunocompetentes no recapitulan los síntomas de la enfermedad humana38,39,40. Tanto en trabajos publicados anteriormente como basados en nuestros experimentos, sólo los animales que carecen de receptores de interferón (IFN) parecen ser susceptibles a la infección por HRTV38,41,42. Hasta la fecha, los esfuerzos de desarrollo de modelos animales se han centrado principalmente en las interacciones entre el patógeno y el huésped, sin examinar a fondo el papel que desempeña el artrópodo vector en la transmisión y patogénesis de la enfermedad. El proceso de alimentación de las garrapatas Ixodid es muy diferente al de otros artrópodos que se alimentan de sangre tanto en lo que respecta a la cantidad de sangre extraída como a la duración de la alimentación. Mientras que la picadura de un mosquito, pulga o mosquito puede completarse en unos pocos minutos, las garrapatas Ixodid se alimentan durante varios días o semanas y aumentan significativamente de tamaño para acomodar una gran cantidad de sangre. Para facilitar la alimentación y evitar la detección, la saliva de las garrapatas ha desarrollado una combinación compleja de compuestos farmacológicamente activos que ayudan a bloquear, modular y suprimir la respuesta del huésped a la picazón y el dolor, la respuesta inmune, la cicatrización de heridas y las respuestas de coagulación43,44. Se ha demostrado que estos compuestos cambian a lo largo del proceso de alimentación y pueden variar entre las etapas de vida de la garrapata45,46. Si bien el propósito de estos compuestos es beneficiar al vector, también crean un entorno permisivo para la transmisión de patógenos a través de un proceso llamado transmisión activada por saliva (SAT) y exacerban el curso de la enfermedad43,47,48,49. Para comprender la transmisión y patogénesis de los virus transmitidos por artrópodos es esencial examinar las interacciones entre patógeno, huésped y vector. Los objetivos generales de estos estudios fueron identificar un modelo animal pequeño que manifestara cambios clínicos y patológicos consistentes con casos humanos de infección por HRTV y luego evaluar el impacto de la saliva de garrapata en la patogénesis.

Distribución conocida de Amblyomma americanum y virus Heartland. Estimaciones actuales de los CDC para la distribución de A. americanum (https://www.cdc.gov/ticks/geographic_distribution.html) superpuestas con la ocurrencia conocida de casos humanos (punto azul), garrapatas infectadas (punto rojo) y animales salvajes seropositivos (punto púrpura). ).

Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio Internacional (AAALAC) en una instalación aprobada por AAALAC. Los protocolos de estudio (1504024 y 0112059) fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Rama Médica de la Universidad de Texas (UTMB). Después de su llegada o traslado a las instalaciones de Nivel 3 de Bioseguridad Animal (ABSL3) de UTMB, se permitió que los animales se aclimataran a las instalaciones. antes del inicio del estudio.

A las garrapatas adultas Amblyomma americanum que estaban libres de patógenos humanos conocidos se compraron en el Departamento de Entomología de la Universidad Estatal de Oklahoma y se les permitió alimentarse de conejos blancos de Nueva Zelanda. Aproximadamente 2 semanas después de la fijación (13 a 15 días), pero antes de completar la alimentación, se eliminaron una garrapata macho y cuatro hembras hinchadas. Las glándulas salivales se diseccionaron, agruparon y almacenaron en 300 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Corning) a –80 °C. Antes del estudio experimental, el extracto combinado de glándulas salivales (SGE) se descongeló sobre hielo húmedo y se homogeneizó en un TissueLyser II (Qiagen). Según el volumen total de la suspensión, cada animal recibió 15 µl de SGE, que era aproximadamente la mitad de una glándula salival.

La cepa MO-4 del virus Heartland, que se aisló del caso humano índice9, fue proporcionada por el Centro de Referencia Mundial para Virus y Arbovirus Emergentes (WRCEVA) (UTMB). El virus se pasó cuatro veces en células Vero E6 (CRL-1586) (Colección Americana de Cultivos Tipo). El título del virus se determinó mediante un ensayo de formación de focos (FFA) adaptado de métodos publicados anteriormente50,51. Se sembraron células Vero E6 en placas de 12 pocillos (Corning) y se dejaron adherir durante la noche. Se suministró un medio de cultivo de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 2 % (Hyclone) y penicilina-estreptomicina al 1 % (Corning) y las placas se mantuvieron a aproximadamente 37 °C con 5 % de CO2. Inmediatamente antes de la infección, se aspiró el medio de las placas y se dispersaron diluciones en serie de HRTV sobre las monocapas celulares por triplicado. Se utilizó una columna de pocillos como control negativo y se le dispensaron medios. Las placas se incubaron durante 1 h y se agitaron suavemente cada 10 a 15 minutos para asegurar la distribución del virus. Después de la incubación, se añadió una capa de metilcelulosa al 0,8 % y las placas se mantuvieron durante 4 días. Se eliminó la metilcelulosa y las placas se fijaron con metanol:acetona (1:1). Se dejó que las placas se secaran al aire por completo. Las membranas celulares se permeabilizaron incubando con Triton X-100 al 0,5% (Sigma-Aldrich) en PBS durante 5 minutos y luego se lavaron con Tween20 al 0,05% (Sigma-Aldrich) en PBS (PBST). Se incubó en pocillos una solución bloqueadora de PBST con suero de cabra al 5% (Sigma-Aldrich) y albúmina sérica bovina al 1% (Fisher Scientific) durante 1 h, seguido de una hora adicional de incubación de líquido ascítico inmune de ratón contra la cepa HRTV MO-4 ( 1:500) (WRCEVA). Las placas se lavaron con PBST antes de una incubación de 1 h con anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:1000) (Invitrogen). Después de otro lavado con PBST, se añadió a cada pocillo sustrato AEC, preparado y utilizado de acuerdo con el kit de sustrato de peroxidasa (HRP) ImmPACT AEC (Vector Labs), y se dejó desarrollar en la oscuridad.

Se realizaron experimentos iniciales para evaluar la susceptibilidad de varias cepas de ratones de laboratorio a la infección por HRTV mediante inyección intraperitoneal (IP) y en la almohadilla plantar (FP) bajo anestesia con isoflurano. Todos los ratones recibieron una única inyección de 1,49 × 105 FFU HRTV y fueron monitoreados hasta 18 días después de la infección (dpi). Se utilizaron grupos de control no infectados para cada cepa de ratón infectado con HRTV. Los ratones de control se agruparon en número, sexo, cepa y edad como ratones infectados experimentalmente, pero recibieron una única inyección IP de PBS en lugar de HRTV. Estos ratones fueron manipulados de la misma manera y sometidos a los mismos procedimientos que los ratones infectados experimentalmente. Primero se evaluaron ratones CD-1 inmunocompetentes y C57BL/6J, adquiridos en Charles River Laboratories (Wilmington, MA) y The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), respectivamente. Ambas cepas de ratones tenían aproximadamente 7 semanas de edad al inicio del estudio. Tras la evaluación de las cepas de ratones inmunocompetentes, se evaluaron dos cepas de ratones con desactivación del receptor de IFN. Se adquirieron ratones inactivados con STAT1, que tienen una respuesta deficiente a IFN-α/γ, de Taconic Biosciences (Germantown, NY) y ratones inactivados con A129, que tienen una respuesta deficiente a IFN-α/β, se criaron y mantuvieron en el entorno específico. Instalación de colonias libres de patógenos en la UTMB. Los ratones STAT1 tenían aproximadamente 5 semanas de edad al inicio del estudio y los ratones A129 tenían de 5 a 6 semanas de edad al inicio del estudio.

Después de la infección, se monitoreó a todos los ratones para detectar manifestaciones clínicas de la enfermedad (Tabla complementaria S1), se recogió sangre completa mediante el seno retroorbitario antes de la infección y cada 2 a 3 días a partir de entonces para evaluar la viremia, y al finalizar el estudio se recogió sangre completa mediante control cardíaco. Se recogió la punción y el bazo, el hígado, los riñones y el músculo adyacente al lugar de la inyección para determinar la carga viral. Los ratones fueron sedados mediante inhalación de isoflurano para la inyección de FP y la extracción de sangre del seno retroorbitario. La eutanasia se realizó mediante inhalación de CO2 seguida de luxación cervical. Las muestras de sangre y tejido se almacenaron en TRIzol LS o TRIzol (ThermoFisher Scientific) hasta su homogeneización para la extracción de ARN y el posterior análisis cuantitativo de rt-PCR.

Se utilizaron dieciocho ratones A129, 10 machos y 8 hembras, para evaluar los efectos de la saliva de garrapata en la patogénesis del HRTV. Debido a la disponibilidad limitada de ratones de 3 semanas de edad, al inicio del estudio se designaron tres ratones hembra de 33 días y una hembra de 22 días como controles no infectados. Los 10 ratones machos y cuatro hembras restantes, todos de 22 días de edad, se pesaron y se designaron para recibir HRTV únicamente o HRTV + SGE. El peso medio de estos grupos fue de 9,32 gy 9,18 g, respectivamente. Todos los ratones recibieron una única inyección de 45 µL en la almohadilla trasera derecha. Los ratones de control negativo recibieron medio de cultivo, los ratones solo con virus recibieron 1,35 × 105 FFU HRTV y los ratones con virus más SGE recibieron 1,35 × 105 FFU HRTV combinados con SGE. La monitorización de la enfermedad clínica y la toma de muestras de sangre se completaron como se describe anteriormente. Se recogieron muestras de sangre completa adicionales durante la eutanasia para análisis hematológicos y de química clínica. Los ratones fueron sacrificados a 3 u 8 ppp y se realizó la necropsia inmediatamente. El bazo, el hígado, los riñones, el cerebro, el corazón, los pulmones, el estómago, el intestino delgado y los testículos, cuando correspondía, se subdividieron y almacenaron en TRIzol para la extracción de ARN o en formalina tamponada neutra al 10 % (Fisher Scientific) para el análisis histopatológico.

Antes de la infección y en el momento de la eutanasia, se recogió sangre completa en tubos que contenían EDTA K3 y se invirtió suavemente hasta que se mezcló. Las muestras se analizaron en la fecha de recolección mediante el instrumento Hemavet 950FS (Drew Scientific). Se evaluaron los siguientes parámetros: recuento de glóbulos rojos y blancos; porcentaje y recuento de leucocitos; hemoglobina; hematocrito; volumen corpuscular medio; Hemoglobina corpuscular media; Concentración de hemoglobina corpuscular media; y plaquetas.

En la eutanasia, se recogió sangre completa en tubos separadores de suero y se analizó en la fecha de recolección. Se dejó que las muestras coagularan durante al menos 20 minutos antes de centrifugarse durante 10 minutos a 1500 xg. El análisis se completó con el instrumento Vetscan VS2 (Abaxis) utilizando rotores Preventive Care Profile Plus. Los parámetros evaluados fueron nitrógeno ureico en sangre, creatinina, alanina aminotransferasa, fosfatasa alcalina, aspartato aminotransferasa, bilirrubina total, glucosa, calcio, proteínas totales, albúmina, globulina, sodio, potasio, cloruro y dióxido de carbono total.

El ARN total se extrajo de muestras de tejido y sangre completa mediante RNeasy Mini Kits (Qiagen, LLC) de acuerdo con métodos publicados anteriormente52 que fueron modificados de la Guía del usuario del reactivo TRIzol y del RNeasy Mini Handbook. Inmediatamente después de la recolección, las muestras de tejido y sangre total se almacenaron en reactivo TRIzol o TRIzol LS, respectivamente. Las muestras se almacenaron refrigeradas durante la noche para permitir la inactivación de patógenos antes de transferirlas a -80 °C hasta que se completara la extracción de ARN. Antes de la extracción, los tejidos se homogeneizaron con TissueLyser II (Qiagen). Las muestras de sangre total no fueron homogeneizadas. La cantidad y pureza del ARN se evaluaron mediante espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Fisher Scientific) o DS-11 + (DeNovix).

La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se completó combinando los componentes de los kits de un solo paso iTaq Universal Probes (Bio-Rad) y la sonda cebadora específica HRTV20. Esta mezcla se distribuyó en placas de PCR de 96 pocillos iQ (Bio-Rad) y se añadió hasta un microgramo de ARN. Las placas se sellaron y se ejecutó qRT-PCR en un sistema de PCR en tiempo real iQ5 (Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del kit iTaq Universal Probes One-Step. Para cuantificar la carga viral, se extrajo ARN de dos muestras de infectividad conocida. El ARN resultante se diluyó en serie, por duplicado, y se realizó qRT-PCR con los mismos materiales y protocolos utilizados para las muestras experimentales. Los valores del ciclo umbral (CT) resultantes se promediaron para cada dilución y se representaron gráficamente con el registro de la concentración viral para generar una ecuación lineal y determinar la curva estándar.

Los tejidos se fijaron con formalina de acuerdo con los procedimientos operativos estándar de UTMB para agentes BSL-3 antes de transferirlos a los laboratorios BSL-2. Los tejidos se incluyeron en parafina y se seccionaron a 5 µm de espesor. Se completó la tinción con hematoxilina-eosina en todos los órganos recolectados y se completó la inmunohistoquímica para el antígeno HRTV para los bazos adaptados de métodos publicados previamente53. Los portaobjetos se desparafinaron y rehidrataron en xilenos y concentraciones decrecientes de etanol. Los portaobjetos se sumergieron en DAKO Target Retrieval Solution (Agilent) y se calentaron en microondas durante 20 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, los portaobjetos se incubaron durante 5 minutos mientras se protegían de la luz en H2O2 al 3% para inactivar la peroxidasa endógena. Se utilizó el kit Mouse-On-Mouse (MOM) (Vector Labs) para reducir la tinción de fondo intensa causada cuando se usan anticuerpos primarios de ratón en tejidos de ratón. Los portaobjetos se incubaron durante 1 h con reactivo de bloqueo de IgG de ratón MOM. El anticuerpo monoclonal (MAb) anti-HRTV de ratón 2AG954 se diluyó 1:250 en diluyente MOM y se incubó durante la noche a 4 °C. El anticuerpo secundario, IgG anti-ratón biotinilada con MOM diluida 1:250 en solución de trabajo de MOM, se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. La incubación con polímero ultrasensible de estreptavidina-peroxidasa (Sigma-Aldrich) seguida del kit ImmPACT AEC Peroxidasa (HRP) (Vector Labs) se completó de acuerdo con los protocolos proporcionados por el proveedor para detectar anticuerpos biotinilados. Los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina de Harris (Fisher Scientific) y se montaron en medio de montaje acuoso Vectamount AQ (Vector Labs).

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 9 (GraphPad). Se promediaron los datos de cada grupo y se calculó el error estándar de la media (SEM) (IC del 95%). Se determinó la significación estadística para los resultados que tenían un valor de p <0,05. Los datos de viremia y carga viral se evaluaron mediante una prueba t no apareada de dos colas con corrección de Welch. Los datos hematológicos se evaluaron mediante la prueba ANOVA de Brown-Forsythe y Welch con la prueba de comparaciones múltiples T3 de Dunnett.

Los ratones de control no infectados utilizados para cada experimento no desarrollaron ningún síntoma clínico, pérdida de peso ni complicaciones en el lugar de la inyección. Los ratones inmunocompetentes CD-1 y C57Bl/6J fueron refractarios a HRTV cuando se infectaron mediante inyección de FP e IP. Todos los ratones utilizados para estos experimentos eran hembras. Se inocularon cinco ratones CD-1 por cada vía. Se inocularon cinco ratones C57BL/6J por cada vía, pero dos ratones del grupo IP no se recuperaron de la anestesia utilizada durante la inoculación. Se realizaron observaciones clínicas y mediciones de peso corporal después de la infección, pero no se desarrollaron signos de enfermedad o pérdida de peso. La sangre se recogió a 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 18 ppp. Un ratón CD-1 que había sido inoculado a través de FP tenía ARN viral detectable a 10 y 18 ppp (Fig. 2). Un ratón C57BL/6J que había sido inoculado mediante la ruta IP tenía ARN viral detectable a 6 ppp, mientras que un ratón C57BL/6J inoculado mediante FP tenía ARN viral detectable a 12 ppp (Fig. 2). No se detectó ARN viral en ningún otro ratón CD-1 o C57BL/6J. A los 18 ppp, todos los ratones supervivientes fueron sacrificados mediante inhalación de CO2 seguida de dislocación cervical. Se realizó una necropsia en todos los ratones para recolectar el bazo, el riñón, el hígado y el músculo adyacente al lugar de la inyección. No hubo observaciones de patología macroscópica. Los órganos se subdividieron y se colocaron en Trizol o en formalina al 10%. La detección viral mediante qRT-PCR indicó que el ARN viral estaba presente en tres de los bazos de los ratones CD-1 infectados con IP, un bazo para los ratones C57BL/6J infectados con IP y un bazo para los ratones C57BL/6J infectados con FP (Fig. 2). El ratón C57BL/6J inoculado con FP que era virémico a 12 ppp era el mismo ratón al que se le detectó virus en el bazo. A ningún otro ratón se le detectó ARN viral en el bazo o la sangre.

Detección de ARN viral en sangre y signos de enfermedad en experimentos de evaluación de susceptibilidad del huésped. ARN viral de HRTV detectado mediante qRT-PCR en sangre (a) y bazo (b) en cepas de ratón. Los ratones fueron expuestos a HRTV mediante inyección en la almohadilla plantar (FP) o intraperitoneal (IP). Cambios de peso corporal (c) y puntuación clínica (d) de ratones A129 después de la exposición a HRTV. Las barras de error muestran SEM.

Los ratones Stat1 tenían una mayor susceptibilidad a HRTV en comparación con los ratones inmunocompetentes. A grupos de seis ratones hembra se les inyectó HRTV mediante la ruta FP o IP. No se observaron síntomas clínicos de enfermedad ni pérdida de peso. La sangre se recogió a 2, 4, 7, 9, 11 y 18 ppp. A 2 ppp, tres ratones inyectados con IP y un ratón inyectado con FP tenían ARN viral detectable (Fig. 2). Un ratón adicional inyectado con FP exhibió ARN viral a 9 ppp. La necropsia se realizó a 18 dpi y no hubo observaciones de patología macroscópica. El ARN viral se detectó mediante qRT-PCR en el bazo de todos los ratones Stat1 inyectados con IP y en todos los bazos menos uno de los ratones inyectados con FP (Fig. 2). También se detectó ARN viral en el hígado de un ratón inyectado con IP al que también se le detectó ARN viral en sangre a 2 ppp.

Los ratones A129 eran susceptibles a HRTV cuando se les inyectaba por vía FP e IP. Se inocularon grupos de seis ratones (tres machos y tres hembras por grupo) el día 0 y se controlaron hasta los 11 ppp. Los síntomas clínicos se desarrollaron a los 2 ppp y alcanzaron su punto máximo entre 3 y 4 ppp para ambos grupos infectados (Fig. 2). Inicialmente, los ratones presentaban un aseo reducido y progresaron a un pelaje opaco o áspero y una actividad reducida en la jaula que era normal cuando se les provocaba. A partir de 4 ppp, los síntomas clínicos de los ratones infectados con FP comenzaron a disminuir en gravedad, pero los ratones no volvieron a la normalidad. Los síntomas clínicos de los ratones infectados por IP no aumentaron ni disminuyeron en gravedad después de 4 ppp.

A los 2 ppp, los ratones infectados comenzaron a perder peso (Fig. 2). Esto no fue consistente entre las rutas de infección o dentro de los grupos. Debido a las diferencias naturales en los rangos de peso entre los ratones, los cambios de peso se evaluaron comparando el cambio porcentual de cada animal con respecto a su peso inicial del día 0. Los ratones infectados con FP tuvieron una pérdida de peso máxima a los 2 ppp con una pérdida promedio del 1,1%; los cambios de peso individuales oscilaron entre una pérdida del 7,5% y una ganancia del 5,1%. A los 6 ppp, el cambio de peso promedio del grupo fue mayor que los pesos iniciales. Aparte de la pérdida de peso del 7,5 % a 2 ppp, ninguna otra medición reflejó una pérdida de peso ≥ 5 % y dos de los tres ratones machos de este grupo no tuvieron ninguna pérdida de peso. La pérdida de peso de los ratones infectados por IP alcanzó su punto máximo a los 6 ppp con una pérdida promedio del 7,3%; los cambios de peso individuales oscilaron entre una pérdida del 15,7% y una ganancia del 2,2%. Todos los ratones de este grupo mostraron pérdida de peso durante el experimento y, aunque un ratón macho tuvo una pérdida de peso máxima del 1,7 %, todos los demás ratones del grupo tuvieron una pérdida > 5 %. A los 11 ppp, todos los ratones excepto una hembra habían comenzado a ganar peso. De los cinco ratones que estaban ganando peso, sólo dos superaron sus valores iniciales.

Se recogió sangre a 2, 4, 6 y 11 ppp y se analizó la presencia de ARN viral mediante qRT-PCR. A una ratona hembra del grupo de infección por FP no se le detectó ARN viral en la sangre. Se detectó ARN viral en todos los demás ratones infectados durante al menos una recolección entre 2 y 6 ppp (Fig. 2). A los 11 ppp no había ARN viral presente. En la necropsia se recogieron el bazo, el riñón, el hígado y el músculo adyacente al lugar de la inyección para realizar análisis de carga viral e histopatología. Se encontró ARN viral en el bazo de todos los ratones infectados mediante qRT-PCR.

Los ratones Stat1 de cinco semanas de edad no desarrollaron signos clínicos de enfermedad, pero tenían ARN viral presente en el bazo y la sangre de la mayoría de los animales infectados. La saliva de garrapata exacerba la enfermedad clínica del virus Heartland en ratones A129.

Todos los ratones recibieron una única inyección de 45 µl en la FP trasera derecha. Los ratones de control no infectados no desarrollaron ninguna reacción en el lugar de la inyección (Fig. 3). Dos ratones que recibieron HRTV solo desarrollaron una ligera hinchazón de la pata trasera en 1 ppp que se expandió para incluir a todos los ratones entre 3 y 4 ppp. La hinchazón aumentó entre 5 y 6 ppp y un ratón tuvo un uso reducido de la extremidad trasera derecha. Estas reacciones comenzaron a resolverse a los 7 ppp y solo un ratón continuó teniendo una ligera hinchazón hasta la finalización del estudio a los 8 ppp. En contraste con el grupo de solo HRTV, a 1 ppp los ratones que recibieron HRTV + SGE tuvieron hematomas e hinchazón moderada en la pata trasera. A los 3 ppp, la hinchazón había progresado hasta incluir la pata trasera derecha y todos los ratones habían reducido el uso de la extremidad afectada. La hinchazón no se había reducido al finalizar el estudio, pero dos ratones recuperaron el uso completo de la extremidad trasera derecha. A los 3 ppp, los ratones del grupo HRTV + SGE comenzaron a tener un aseo reducido y los signos clínicos de enfermedad alcanzaron su punto máximo en este grupo a los 5 ppp cuando se les presentó un pelaje opaco o áspero y una actividad reducida que se volvió normal cuando se les provocó. Los síntomas se resolvieron en estos animales entre 7 y 8 ppp. Los síntomas clínicos solo se observaron en el grupo de HRTV únicamente a 5 ppp, donde los ratones habían reducido su aseo. Las reacciones en el lugar de la inyección y los síntomas clínicos fueron más graves en los animales HRTV + SGE en comparación con los animales solo HRTV. Además, la aparición de los síntomas se produjo antes y tuvo una mayor duración en los animales HRTV + SGE.

Signos clínicos de enfermedad y detección de ARN viral en el impacto de la saliva de garrapata en el experimento de patogénesis de HRTV. Los animales fueron observados y pesados diariamente para evaluar la enfermedad y se les asignó una puntuación acumulativa según la tabla de puntuación de la Tabla S1. Se muestran las puntuaciones clínicas individuales y los cambios de peso corporal desde el inicio (a,b). Se extrajo sangre a intervalos posteriores a la infección y se recogieron tejidos al finalizar para determinar la carga viral mediante qRT-PCR (c – e). Los datos de carga viral se expresan como equivalentes de FFU por microgramo de ARN después de la normalización a una curva estándar. La significación estadística entre los grupos infectados se determinó mediante una prueba t de dos colas no apareada con la corrección de Welch. Las barras de error muestran SEM.

A 1, 3, 5 y 8 ppp se recogió sangre para evaluar la presencia de ARN viral. Todos los ratones infectados tenían ARN viral detectable en la sangre y esto fue significativamente mayor en el grupo HRTV + SGE que en el grupo HRTV solo a 1 ppp (p = 0,095) y 3 ppp (p = 0,0012) (Fig. 3). El ARN viral persistió más tiempo en la sangre de ratones HRTV + SGE. A 8 ppp, uno de los tres ratones solo HRTV todavía tenía ARN viral detectable, pero tres de tres ratones HRTV + SGE tenían ARN viral detectable. Los ratones del grupo HRTV + SGE también tuvieron cargas virales más altas en el bazo (p = 0,0134), hígado (p = 0,0189), cerebro (p = 0,0164), intestino (p = 0,005), pulmón (p = 0,042) y testículos a 3 ppp que los ratones solo HRTV (Fig. 3). No se pudo determinar la significación estadística para los testículos debido al pequeño tamaño de la muestra de cada grupo (n = 2). A diferencia de los experimentos de susceptibilidad del huésped con ratones A129, se observó esplenomegalia en todos los ratones infectados en ambos momentos de la necropsia. Esto puede deberse a que se utilizaron ratones más jóvenes para experimentos con saliva de garrapata. No se recogieron los pesos de los órganos, pero según las observaciones y fotografías tomadas durante la necropsia, así como las diapositivas del bazo, la esplenomegalia fue menos grave en el grupo de HRTV únicamente.

La sangre extraída antes de la infección y en la necropsia para análisis hematológicos mostró cambios drásticos con respecto a los niveles iniciales a 3 y 8 ppp para ambos grupos infectados (Fig. 4). Los recuentos de plaquetas se mantuvieron estables entre las mediciones iniciales y de 3 ppp y aumentaron en el grupo HRTV + SGE a 8 ppp (Fig. 4, Tabla complementaria S2). Ambos grupos de ratones infectados tenían recuentos de glóbulos blancos levemente elevados a 3 ppp y mucho más elevados a 8 ppp. Esto fue más pronunciado en el grupo HRTV + SGE. A pesar del aumento del recuento de glóbulos blancos, ambos grupos infectados habían agotado los linfocitos a los 3 ppp. El grupo HRTV + SGE se redujo significativamente en comparación con los ratones de control (p = 0,0020) y estos valores no habían regresado a los niveles iniciales a 8 ppp (Fig. 4). Ambos grupos infectados demostraron un aumento de neutrófilos después de la infección con mayores aumentos en el grupo HRTV + SGE tanto a 3 ppp (p = 0,0005) como a 8 ppp (p = 0,0153) (Fig. 4) en comparación con los ratones de control. La sangre extraída en la necropsia para la química clínica no fue concluyente (Tabla complementaria S3).

Hematología Los parámetros hematológicos se evaluaron en sangre completa extraída a terminaciones de 3 ppp y 8 ppp. Los parámetros evaluados incluyeron leucocitos totales (a,b), plaquetas (c,d) y porcentajes de neutrófilos (e,f), linfocitos (g,h), monocitos (i,j), eosinófilos (k,l) y basófilos (m,n). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba ANOVA de Brown-Forsythe y Welch con la prueba de comparaciones múltiples T3 de Dunnett. Las barras de error muestran SEM.

Los hígados exhibieron una inflamación mixta del tracto porta y la vena central presente a los 8 ppp y que fue más grave en el grupo HRTV + SGE (Fig. 5, Tabla complementaria S4). Se observaron megacariocitos a 3 y 8 ppp, pero fueron más prevalentes en ratones HRTV + SGE. Se observó un aumento de la celularidad en los espacios sinusoidales en ambos grupos en ambos momentos, pero no se pudo determinar el fenotipo celular. Las lesiones lobulares similares a granulomas con infiltrados eosinofílicos fueron más prevalentes a los 3 ppp y en los ratones HRTV solamente. Los bazos de todos los ratones infectados tenían hematopoyesis extramedular (EH), pulpa blanca agotada y centros germinales ausentes (Fig. 6, Tabla complementaria S5). Las puntuaciones de EH fueron ligeramente superiores en el grupo HRTV + SGE a 3 ppp, pero no fueron diferentes a 8 ppp. Ambos grupos infectados tenían un diámetro promedio ligeramente reducido de la vaina linfoide periarteriolar (PALS) a 3 ppp. Los ratones de control no infectados tuvieron una puntuación PALS promedio de 307,79 (± 20,59), mientras que los ratones solo HRTV fueron 280,75 (± 46,06) y los ratones HRTV + SGE fueron 282,98 (± 20,26). El antígeno viral fue más prevalente en el grupo HRTV + SGE a los 3 ppp y fue similar entre los grupos infectados a los 8 ppp (Fig. 7, Tabla complementaria S5). Esto fue consistente con el análisis de carga viral del bazo.

Patología hepática La tinción con hematoxilina y eosina de secciones de hígado mostró varios cambios histopatológicos en ratones infectados. Controle la histología de un ratón no infectado con el tracto porta (PT) y la vena central (CE) que se muestran (a). La patología de los ratones infectados incluyó inflamación de la vena porta con venulitis portal y central (PV, CV) (b), inflamación neutrofílica del tracto porta (c), megacariocitos lobulares (flecha negra, d), inflamación lobular (flecha blanca, e), y lesiones lobulillares tipo granuloma con infiltrados eosinofílicos (punta de flecha negra, f y punta de flecha blanca, g). Las observaciones patológicas completas están disponibles en la tabla S4.

Patología del bazo La tinción con hematoxilina y eosina de secciones del bazo mostró varios cambios histopatológicos en ratones infectados. Controlar la histología de un ratón no infectado (a) con estructura normal. Reducción del diámetro promedio de PALS medido en ratones infectados con HRTV (b) y HRTV + SGE (c) a 3 ppp. Se observó un aumento de la hematopoyesis en los bazos de ratones HRTV + SGE a 3 ppp (c), ratones HRTV a 8 ppp (d) y ratones HRTV + SGE (e) a 8 ppp. Pulpa blanca agotada y ausencia de centros germinales (b – e) en grupos infectados a 3 ppp y 8 ppp. Observaciones patológicas completas y promedios PALS para todos los ratones ubicados en la tabla S5.

Detección del antígeno HRTV en bazos La inmunohistoquímica (IHC) se realizó en secciones de bazo para visualizar el antígeno HRTV (señal roja) y se contratiñó con hematoxilina. Imágenes representativas de bazo no infectado con tinción mínima no específica (a), ratón infectado con HRTV a 3 ppp (b), ratón infectado con HRTV + SGE a 3 ppp (c), ratón infectado con HRTV a 8 ppp (d) y HRTV + SGE ratón infectado a 8 ppp (e). Puntuación de la gravedad del antígeno para todos los animales ubicados en la tabla S5. Las barras de escala son de 500 µm para los paneles (a – e) y de 200 µm para imágenes insertadas.

Los estudios de susceptibilidad del huésped realizados aquí y descritos anteriormente han demostrado que muchas especies de animales inmunocompetentes, incluidos ratones CD-1 y C57Bl/6, hámsteres, conejos, pollos, cabras y mapaches, son refractarios a la infección por HRTV38. Se ha demostrado que ratones y hámsteres con deficiencia de receptores de interferón tienen diversos grados de susceptibilidad a HRTV38,39,40,41,42. Se ha demostrado que los hámsteres Stat2 de 4 a 5 semanas de edad y los ratones A129 de 5 a 6 semanas de edad, ambos deficientes en el receptor de IFN-α/β, manifiestan síntomas clínicos de enfermedad, desarrollan viremia y se ha aislado ARN viral en órganos. La mortalidad se produjo en un pequeño porcentaje de hámsteres Stat241. Los ratones AG129 con deficiencia del receptor de IFN-α/β/γ de tres semanas de edad eran muy susceptibles a la infección por HRTV y se ha demostrado que desarrollan una enfermedad clínica grave similar a los casos mortales en humanos38. A pesar de la similitud con los casos humanos graves, la dosis letal calculada del 50 % (LD50) en ratones AG129 fue de 9 unidades formadoras de placas (UFP)38. Los ratones IFNAR-/- de siete a 11 semanas de edad desarrollaron una enfermedad clínica grave de manera dependiente de la dosis cuando se les inyectó por vía subcutánea, intraperitoneal o intravenosa42. Con base en la baja LD50 calculada para ratones AG129 y los resultados de experimentos que utilizan animales con deficiencia del receptor de IFN-α/β, se determinó que los ratones A129 de 3 semanas de edad serían el modelo óptimo para investigar los factores salivales del vector artrópodo, A. americanum. , para exacerbar la enfermedad HRTV. En este trabajo hemos demostrado que los ratones A129 desarrollan un curso de enfermedad no letal con similitudes con los casos humanos de HRTV, que incluyen esplenomegalia, infección de múltiples órganos y cambios patológicos en el hígado y el bazo.

Los casos humanos de HRTV a menudo se caracterizan por trombocitopenia y leucopenia9,14,16, pero estas no se observaron en ratones A129. Esto puede deberse a diferencias en los tiempos posteriores a la exposición cuando se realiza el muestreo. Para nuestro trabajo, estos parámetros no se evaluaron después de 8 ppp, mientras que un ser humano expuesto puede no saber cuándo estuvo expuesto o buscar atención médica hasta que haya estado enfermo durante varios días.

Además, cuando HRTV se combina con A. americanum SGE, la gravedad y la duración de la enfermedad aumentan en comparación con la infección por virus solo. La saliva de las garrapatas contiene un repertorio de factores proteicos y no proteicos farmacológicamente activos que se sabe que facilitan la alimentación sanguínea y la transmisión de patógenos. Los factores salivales de las garrapatas crean un ambiente permisivo para la transmisión de patógenos y aumentan la gravedad a través de SAT43,47,48,49,52. Nuestro resultado resalta la necesidad de considerar las interacciones entre patógeno, huésped y vector durante el desarrollo de modelos animales para arbovirus, ya que se ha demostrado que el proceso de alimentación del vector crea un ambiente permisivo para la transmisión de enfermedades y mejora la gravedad a través de SAT43,47,48,49 ,52. La identificación y caracterización de factores salivales que mejoran la transmisión de HRTV nos permitirá comprender mejor la biología de la transmisión de HRTV. El modelo animal descrito aquí será útil para determinar los componentes específicos de la saliva de las garrapatas que afectan el curso de la enfermedad. El aislamiento de estos componentes podría proporcionar objetivos potenciales para el desarrollo de vacunas que bloqueen la transmisión de enfermedades o potencialmente detengan las picaduras de garrapatas al impedir la alimentación.

Como varias especies de garrapatas pueden transmitir múltiples patógenos, una vacuna que impida una alimentación exitosa tiene el potencial de ser mucho más efectiva que desarrollar vacunas para patógenos individuales, pero puede ser mucho más difícil de diseñar. Se ha demostrado que la composición de la saliva de la garrapata varía entre especies de garrapatas y etapas de vida, así como cambios a lo largo del proceso de alimentación y en respuesta al huésped del que se alimenta la garrapata43,44,45,46,48,49,55,56 . Es posible que no sea posible identificar un único factor salival en múltiples especies y etapas de vida de la garrapata. La composición cambiante de la saliva de las garrapatas a lo largo del proceso de alimentación presenta un desafío adicional para el desarrollo de vacunas. La duración de la unión necesaria para que Ixodes scapularis transmita diversos patógenos se ha estudiado bastante bien; algunos patógenos se transmiten tan rápido como 15 minutos después de la unión, mientras que otros patógenos pueden tardar entre 24 y 48 h57,58,59. El tiempo mínimo de fijación de garrapatas requerido para otras especies de garrapatas y patógenos, incluidos A. americanum y HRTV, ha sido poco estudiado y requeriría experimentos adicionales para identificar factores salivales que se presentan lo suficientemente temprano en el proceso de alimentación de las garrapatas para prevenir la transmisión de enfermedades.

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La financiación fue proporcionada por NIAID/NIH (Número de subvención: R21 AI113128).

Centro SUNY para Enfermedades Transmitidas por Vectores, Upstate Medical University, Syracuse, NY, EE. UU.

Erin S. Reynolds y Saravanan Thangamani

Instituto de Salud Global y Ciencias Traslacionales, Upstate Medical University, Syracuse, Nueva York, EE. UU.

Erin S. Reynolds y Saravanan Thangamani

Departamento de Microbiología e Inmunología, Upstate Medical University, Syracuse, Nueva York, EE. UU.

Erin S. Reynolds y Saravanan Thangamani

Departamento de Patología, Universidad de Ciencias Médicas de Arkansas, Little Rock, AR, EE. UU.

Jacob T. Wooldridge

Departamento de Patología, Rama Médica de la Universidad de Texas en Galveston, Galveston, TX, EE. UU.

Heather Stevenson

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ESR: diseñó y comisarió el estudio; analizó los datos; escribió el primer borrador del manuscrito. JTW: analizó los datos; editó el manuscrito. HS: analizó los datos; editó el manuscrito. ST: conceptualizó, diseñó y curó el estudio; analizó los datos; contribuyó con reactivos, materiales y herramientas/software de análisis; financiación asegurada para el estudio; editó el manuscrito.

Correspondencia a Saravanan Thangamani.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reynolds, ES, Wooldridge, JT, Stevenson, HL et al. Los factores salivales de la garrapata Lone Star, Amblyomma americanum, exacerban el resultado clínico de la enfermedad por el virus Heartland en un modelo animal pequeño. Representante científico 13, 13304 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40397-x

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Recibido: 17 de abril de 2023

Aceptado: 09 de agosto de 2023

Publicado: 16 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40397-x

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