Los factores de señal difusibles (DSF) se unen y reprimen a VirF, el principal activador de virulencia de Shigella flexneri

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13170 (2023) Citar este artículo

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Shigella, el agente etiológico de la disentería bacilar humana, controla la expresión de sus determinantes de virulencia a través de una cascada de activadores transcripcionales estimulados ambientalmente. VirF es el activador principal y es esencial para la expresión adecuada de la virulencia. En este trabajo, informamos sobre experimentos in vitro e in vivo que muestran que dos autoinductores de la familia DSF, XcDSF y BDSF interactúan con el módulo jelly roll de VirF provocando su inhibición y afectando la expresión de todo el sistema de virulencia de Shigella, incluyendo su capacidad de invadir las células epiteliales. Proponemos un modelo molecular que explica cómo la unión de XcDSF y BDSF provoca la inhibición de VirF al prevenir su dimerización. En general, nuestros resultados experimentales sugieren que XcDSF y BDSF pueden contribuir a la "resistencia a la colonización" en el intestino humano o, alternativamente, pueden explotarse para ajustar la expresión de virulencia de Shigella a medida que la bacteria migra desde la luz para acercarse a la mucosa intestinal. Nuestros hallazgos también destacan cómo una comprensión detallada de la interacción de los ligandos de DSF con VirF puede contribuir al desarrollo racional de fármacos antivirulentos innovadores para tratar la shigelosis.

Shigella es una bacteria Gram-negativa enteropatógena responsable de la shigelosis, una enfermedad que afecta a unos 125 millones de personas anualmente en todo el mundo, con un desenlace mortal en aproximadamente 164.000 casos1,2. Para infectar la mucosa intestinal humana, Shigella aprovecha un sistema de secreción específico de tipo III (T3SS) para promover la invasión bacteriana mediante la inyección de una serie de factores en el citoplasma de la célula huésped3. Los genes que codifican el componente proteico de este T3SS, los factores implicados en su ensamblaje y los efectores inyectables están agrupados en una gran región similar a una isla de patogenicidad (PAI) dentro del plásmido de virulencia de Shigella (pINV)4. La expresión de los genes T3SS está controlada por una cascada regulatoria desencadenada por el regulador transcripcional AraC-XylS VirF, que se encuentra en la parte superior de la cascada5,6. La proteína VirF promueve la transcripción de dos genes críticos para la virulencia de Shigella, icsA y virB. La proteína IcsA participa en la motilidad bacteriana intracelular7,8 y la proteína VirB, actuando como segundo regulador positivo del sistema de virulencia, es responsable de la expresión de los niveles subyacentes de la cascada reguladora de Shigella9,10. Cabe destacar que los genes virF, virB e icsA son genes de plásmidos pINV ubicados fuera de la región similar a PAI. VirF está regulado a nivel transcripcional por varios estímulos ambientales, como temperatura, pH y osmolaridad, y a nivel postranscripcional por MiaA10. Muy recientemente, hemos demostrado que la actividad de VirF también está controlada directamente por los ácidos grasos (AG)11. En particular, los ácidos grasos como el ácido láurico, cáprico, miristoleico, palmitoleico y sapienico se unen a VirF e inactivan su actividad promotora de la transcripción, probablemente haciendo que la estructura de la proteína cambie de un estado libre y funcional (“abierto”) a un estado unido a FA. , forma no funcional (“cerrada”). Un mecanismo similar que involucra AG se ha propuesto previamente para otros reguladores de virulencia, como ToxT de V. cholerae, Rns de E. coli enterotoxigénica (ETEC) y HilD de Salmonella enterica12,13,14. Recientemente, el ácido cis-2-hexadecenoico se incluyó entre los ligandos que se unen e inhiben HilD, influyendo así en la expresión del gen de virulencia de S. enterica14,15. Este compuesto pertenece a una clase rara de AG, sintetizados por bacterias Gram negativas, llamados “factores de señal difusibles” (DSF). Los DSF incluyen AG con diferentes longitudes de cadena y patrones de ramificación con un enlace cis insaturado en la posición 2, excepto el ácido 13-metiltetradecanoico (LeDSF). Además, se ha demostrado que los DSF sirven como moléculas de señalización en sistemas bacterianos de detección de quórum (QS)16,17 y regulan diversas funciones en una amplia gama de bacterias, incluidos patógenos de plantas y animales17,18. Una molécula prototipo de DSF es el ácido cis-11-metil-2-dodecenoico (XcDSF) producido por la bacteria fitopatógena Xanthomonas campestris17,19. Otros miembros importantes de la familia DSF previamente caracterizados incluyen el ácido cis-2-decenoico (PDSF); ácido cis-2-dodecenoico (BDSF); ácido cis,cis-11-metildodeca-2,5-dienoico (CDSF); ácido cis-10-metil-2-dodecenoico (IDSF); ácido cis-2-tetradecenoico (XfDSF1); y ácido cis-2-hexadecenoico (XfDSF2). Las bacterias que sintetizan DSF forman parte de una lista constantemente actualizada y se caracterizan por la presencia del gen rpfF (o un homólogo del mismo), crucial para la síntesis de DSF17,20. Hasta la fecha, la lista de productores de DFS comprende Xanthomonas spp., Xylella fastidiosa, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Lysobacter enzymogenes y brunescens, Leptospirillum ferrooxidans, Burkholderia cenocepacia y Cronobacter turicensis17. También se pueden incluir bacterias pertenecientes a los géneros Frateuria, Luteobacter, Pseudoxhantomonas y Rhodanobacter basándose en la predicción in silico17. El locus genético responsable tanto de la producción de DSF como de su reconocimiento como señal de detección de quórum se ha caracterizado por primera vez en X. campestris e incluye cuatro genes, rpfC, rpfG, rpfB y rpfF18,21,22. RpfC y RpfG forman un sistema de dos componentes, mientras que RpfB es una ligasa para moléculas de acil-CoA de cadena larga. RpfF es una enzima de la superfamilia crotonasa (actividades enoil-CoA deshidratasa y tioesterasa) y actúa sobre una proteína transportadora de acilo (acil-ACP), un intermedio de la síntesis de ácidos grasos, para sintetizar XcDSF. Cuando la población bacteriana alcanza una densidad crítica, XcDSF interactúa con el sensor RpfC induciendo la fosforilación de la proteína reguladora de respuesta RpfG. Debido a su actividad hidrolítica, el RpfG fosforilado convierte el segundo mensajero bis-(3'-5')-GMP cíclico (c-di-GMP) en GMP. Una disminución del c-di-GMP intracelular conduce a la desregulación de los genes diana18. En Burkholderia cenocepacia, la biosíntesis de moléculas DSF (BDSF) depende completamente de RpfFBc, una enzima bifuncional con actividad enoil-CoA hidratasa y tioesterasa. Esta enzima exhibe una identidad de secuencia significativa con la proteína RpfF de X. campestris. A pesar de la gran similitud de XcDSF y BDSF en la vía biosintética y la estructura química, el mecanismo por el cual B. cenocepacia detecta BDSF difiere del caracterizado en X. campestris ya que involucra un receptor citoplásmico, la proteína RpfR. Esta enzima exhibe actividad di-GMP fosfodiesterasa cíclica una vez unida a BDSF, lo que provoca que el c-di-AMP citoplasmático disminuya23. Curiosamente, este mecanismo de reconocimiento y regulación se parece mucho a la interacción entre HilD y el ácido cis-2-hexadecenoico, que provoca la supresión de la virulencia de S. enterica. Teniendo en cuenta la alta similitud estructural entre XcDSF, BDSF y ácido láurico (Fig. S1), un inhibidor previamente caracterizado de la actividad de VirF, preguntamos si XcDSF y BDSF podrían inhibir la virulencia de Shigella al prevenir la actividad promotora de la transcripción de la proteína VirF. En el presente estudio demostramos, mediante experimentos in silico, in vitro e in vivo, que XcDSF y BDSF interactúan directamente con VirF, lo que lleva a una disminución significativa en la transcripción de virB, dificultando así la expresión de todo el sistema de virulencia de Shigella y provocando una Fenotipo defectuoso caracterizado por una invasión insuficiente de las células huésped y por un retraso en la proliferación dentro de ellas.

Para investigar el posible efecto inhibidor de las moléculas de DSF en el sistema de virulencia de Shigella, inicialmente determinamos las concentraciones subinhibitorias de XcDSF o BDSF en el crecimiento de la cepa M90T de Shigella en medio LB. La longitud de la cadena de ambos DSF es equivalente a la del ácido láurico, que previamente hemos demostrado que es un inhibidor eficaz de VirF11. Para este propósito, se agregaron concentraciones crecientes de XcDSF o BDSF a cultivos de M90T hasta una concentración final de 0,2 %, 0,02 % o 0,002 %, y luego se monitorizó el crecimiento. Las curvas de crecimiento (Fig. S2A y B) sugieren claramente que, para ambos DSF, el 0,02% es la concentración más alta en la que el crecimiento no se ve influenciado significativamente. Por lo tanto, mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) después de la exposición de los cultivos a XcDSF o BDSF al 0,02%, estudiamos la transcripción del gen virF y virB dependiente de VirF. Además, ampliamos el análisis al gen icsA para confirmar aún más el posible efecto inhibidor que XcDSF y BDSF pueden tener sobre la actividad de VirF para promover la transcripción. En comparación con la cepa no tratada (NT), el nivel relativo de transcripción de virF aumenta ligeramente, mientras que el nivel de transcripciones de virB e icsA se reduce en aproximadamente un 70 % y un 60 % a 65 % respectivamente (Fig. 1). Para probar si la disminución de la transcripción del gen virB, crucial para la expresión correcta de todo el sistema de virulencia de Shigella, depende de la modulación negativa de la traducción de VirF, realizamos un ensayo de transferencia Western con extractos de proteínas totales de cultivos de Shigella M90T que expresan VirF-Flag. -proteínas marcadas (M90T VirF-FT) o marcadas con VirB-Flag (M90T VirB-FT) cultivadas en presencia de XcDSF y BDSF. El análisis densitométrico comparativo de las bandas de proteínas muestra que los niveles de proteínas VirF (Fig. 2A) y VirB (Fig. 2B) son consistentes con los perfiles transcripcionales, lo que confirma que la cantidad de proteína VirF no se ve afectada por la presencia de DSF probados. En general, estos datos sugieren que XcDSF y BDSF impactan la transcripción de virB mediante la inhibición de la actividad que promueve la transcripción de VirF.

Análisis comparativo de perfiles transcripcionales de los genes virF, virB e icsA en S. flexneri después del tratamiento con XcDSF o BDSF. Análisis comparativo de los perfiles transcripcionales de los genes virF, virB e icsA en la cepa M90T S. flexneri cultivada en presencia o ausencia de XcDSF y BDSF al 0,02%. Los datos se obtienen mediante qRT-PCR y los valores se comparan con la muestra no tratada correspondiente establecida en 1. Los resultados son un promedio de al menos tres experimentos independientes realizados por triplicado. Las barras de error representan SD. La significación estadística se determinó con una prueba t de Student de dos colas pareada utilizando las mediciones de las muestras tratadas y no tratadas como un conjunto de datos. *p ≤ 0,01.

Perfiles traduccionales comparativos de las proteínas VirF y VirB en S. flexneri después del tratamiento con XcDSF o BDSF. Análisis de transferencia Western de las proteínas VirF (A) y VirB (B) en la cepa M90T S. flexneri cultivada en ausencia o presencia de XcDSF y BDSF al 0,02 %. Las imágenes de transferencia Western son representativas de tres experimentos independientes. Los valores del análisis densitométrico de todos los experimentos se utilizaron para realizar los gráficos de barras debajo del WB correspondiente. Los valores se obtuvieron normalizando los niveles de proteína VirF y VirB con los de la proteína OmpA y se compararon con los valores de las muestras no tratadas (NT) establecidas en 1. Las barras de error representan SD. La significación estadística se determinó con una prueba t de Student de dos colas pareada. *p ≤ 0,01.

Con base en los datos presentados en la sección anterior, planteamos la hipótesis de que XcDSF y BDSF pueden actuar de manera similar a otros ácidos grasos (AG) que hemos estudiado recientemente11, es decir, pueden interactuar directamente con el módulo de gelatina VirF, una subestructura proteica compuesta por ocho cadenas beta dispuestas en dos láminas de cuatro cadenas, lo que lleva a un cambio estructural y en consecuencia a la inhibición de la actividad VirF promotora de la transcripción. Probamos esta hipótesis mediante un ensayo en placa de interacción ADN-proteína (DPIPA)11 destinado a explorar la interacción de la proteína VirF purificada (MalE-VirF) con PvirB, un amplicón etiquetado con FITC de 194 pb que abarca el sitio de unión proximal de VirF a el promotor virB24. Los resultados (Fig. 3) revelan que la relación relativa de unión de la proteína MalE-VirF al ADN de PvirB en presencia de XcDSF y BDSF es 0,38 y 0,37, respectivamente, en comparación con muestras no tratadas (establecidas en 1), lo que indica que la dos DSF afectan claramente la interacción de VirF con el promotor virB. Se ha demostrado que la dimerización es un requisito esencial para que VirF (así como para las proteínas ToxT y Rns) se una al ADN y active la expresión de los genes diana25,26,27,28. Es posible que la unión de XcDSF o BDSF pueda influir en la dimerización de VirF. Para explorar esta hipótesis, se realizó un análisis de acoplamiento molecular utilizando la estructura del modelo VirF que predijimos previamente11. La alineación estructural de la estructura VirF unida a XcDSF predicha y la estructura dimérica del regulador maestro Rns de E. coli en forma apo (PDB: 6XIU, 37 % de identidad de secuencia)13 respalda un mecanismo de inhibición de la dimerización de VirF por los dos DSF. probado (Fig. 4). En particular, la disposición de la hélice α3 altamente conservada de VirF, que es homóloga a la hélice de Rns que forma la interfaz homodímera, se predice en un ángulo que evita la dimerización cuando se produce la unión a los dos DSF. Dado que la hélice α3 de VirF es crucial para la dimerización25, esta observación sugiere que la unión de XcDSF o BDSF podría inhibir la dimerización y la posterior unión al ADN de VirF, al influir en la posición de la hélice α3.

Evaluación in vitro de la unión de VirF al promotor virB en presencia o ausencia de XcDSF o BDSF. El gráfico de barras muestra la cantidad de fluorescencia emitida por el ADN FITC de PvirB retenido en los pocillos por la proteína VirF en ausencia o presencia de XcDSF o BDSF al 0,02 %. El experimento se realizó utilizando concentraciones saturadas del fragmento de ADN FITC de PvirB (75 ng) y los resultados son un promedio de al menos tres experimentos independientes, cada uno de ellos realizado por triplicado. Las barras de error representan SD. La significación estadística se determinó con una prueba t de Student de dos colas pareada. *p ≤ 0,01.

Modelo de acción propuesto de XcDSF o BDSF. El modelo planteado como hipótesis en la figura se basa en la similitud estructural entre VirF y los demás miembros de la familia AraC. Según esta hipótesis, la unión de XcDSF o BDSF al dominio jelly-roll es responsable de una reorientación alostérica de la hélice α3, que a su vez forma parte de la interfaz del dímero de VirF. Esta transición alostérica previene la formación de dímeros y la posterior unión al ADN.

Para investigar si la interacción de XcDSF y BDSF con la proteína VirF también ocurre in vivo, evaluamos la transcripción de virB mediante qRT-PCR en una cepa M90T ΔvirF que alberga los plásmidos pVirFH17A, pVirFH212A y pVirFH17A/212A (Tabla S3). Estas cepas expresan proteínas VirF mutadas que ya no son sensibles a la inhibición de los ácidos grasos, incluido el ácido láurico11. El análisis de acoplamiento molecular predice claramente que, de manera similar al caso del ácido láurico, los residuos de VirF H17 y H212 deberían ser muy relevantes para la interacción XcDSF- o BDSF-VirF (Fig. 5A). El resultado de los ensayos qRT-PCR muestra que el nivel relativo de transcripción de virB en las cepas que portan la forma mutada de VirF y tratadas con XcDSF o BDSF es equivalente al detectado en muestras no tratadas, mientras que el nivel de transcripción de virB en la cepa que expresa la La proteína VirF de tipo salvaje disminuye fuertemente (hasta aproximadamente un 30%) (Fig. 5B). Estas observaciones confirman que ambas mutaciones impactan la regulación de virB, aboliendo la represión dependiente de XcDSF-/BDSF, y junto con los resultados in vitro sugieren fuertemente que la interacción de XcDSF y BDSF con VirF también ocurre in vivo, causando la reducción de la expresión de VirB. y, por tanto, de todo el sistema de virulencia.

Papel de los residuos H17 y H212 en la interacción XcDSF y BDSF con la proteína VirF. (A) Se muestra el modelo dimérico de VirF, con un monómero representado como una superficie gris y el otro como una caricatura blanca. XcDSF se representa como barras verdes, mientras que los dos residuos de histidina que interactúan con el ligando son barras cian/azul. El panel representa la cavidad que aloja el ligando y se muestran los residuos de histidina que se predice que interactuarán con el ligando. (B) El gráfico muestra la transcripción relativa del gen virB en presencia de la proteína de tipo salvaje VirF, los derivados H17A, H212A y H17A/H212A tratados con XcDSF al 0,02 % (barras de color gris oscuro) o BDSF (barras de color gris claro). ). Los valores relativos se calcularon utilizando los de la muestra no tratada correspondiente, establecidos en 1. Los resultados son un promedio de al menos tres experimentos independientes realizados por triplicado. Las barras de error representan SD. La significación estadística se determinó con una prueba t de Student de dos colas utilizando el conjunto de mediciones de las muestras tratadas y no tratadas. *p ≤ 0,01.

Dado el impacto significativo de XcDSF y BDSF en la cascada de virulencia de Shigella, preguntamos si esto era suficiente para afectar su fenotipo invasivo y su capacidad proliferativa en las células epiteliales. Por lo tanto, realizamos un ensayo de infección de protección con gentamicina en una monocapa de células epiteliales Caco-2, utilizando la cepa M90T Shigella cultivada en presencia de XcDSF o BDSF al 0,02%. Al permitir que la infección prosiguiera durante 4 h, se evaluaron las bacterias intracelulares viables en diversos puntos temporales (T0 a T4) lisando las monocapas infectadas y midiendo el recuento bacteriano viable (UFC/ml). Esto nos permitió calcular la invasión de Shigella (T0) y su proliferación intracelular (T1 a T4). Los porcentajes de bacterias M90T que invadieron células Caco-2 después del tratamiento con XcDSF o BDSF a T0 fueron del 24% y el 22% respectivamente (Fig. 6A). En cuanto a la proliferación intracelular, los resultados muestran claramente que las células de Shigella tratadas con XcDSF y BDSF proliferan más tarde en las células epiteliales que las bacterias no tratadas, con un retraso de al menos 1 hora (Fig. 6B). En conjunto, estos resultados indican que el tratamiento con XcDSF y BDSF tiene un impacto significativo en la entrada de Shigella en las células epiteliales, provocando así un retraso en la proliferación intracelular.

Evaluación de la entrada y proliferación de Shigella en la célula epitelial. Medición de células intracelulares viables de S. flexneri en T0 (A) o durante 4 h de incubación pi (de T0 a T4) (B). La infección de células Caco-2 se llevó a cabo a MOI 100 con S. flexneri M90T cultivado en ausencia (NT) o con XcDSF o BDSF al 0,02%. Los resultados son el promedio de al menos tres experimentos independientes. La significación estadística se determinó con una prueba t de Student de dos colas (A) o el análisis de varianza de dos vías (ANOVA) (B) (p = 0,04). Las barras de error representan la SD.

La comunidad microbiana del intestino humano, también denominada "microbiota" humana, está formada por casi 3.000 especies microbianas, principalmente bacterias (90%)29. Su densidad y diversidad aumentan progresivamente a lo largo del tracto gastrointestinal. Las partes superiores del intestino, el estómago y el duodeno proximal normalmente están colonizadas sólo por comunidades microbianas relativamente simples que pueden soportar condiciones ácidas y la presencia de bilis y enzimas pancreáticas. La mayor densidad y diversidad microbiana se encuentra en el colon, donde el tiempo de tránsito es más lento y hay mayor disponibilidad de nutrientes30. La microbiota intestinal contribuye a muchas funciones importantes del cuerpo humano, incluida la digestión, la función endocrina intestinal, la señalización neurológica y la formación y desarrollo del sistema inmunológico. También contribuye a la integridad de la mucosa intestinal, aporta vitaminas y nutrientes y contrarresta la colonización por patógenos31,32,33. Los componentes bacterianos de la microbiota humana utilizan la detección de quórum (QS) para comunicarse entre sí. Este mecanismo, basado en la síntesis, liberación, reconocimiento y respuesta a moléculas de señalización, llamadas autoinductores, permite la coordinación de las actividades bacterianas en el intestino, no sólo entre diferentes especies microbianas sino también en lo que respecta a su interacción con el huésped34. En el intestino humano, se han identificado autoinductores producidos por bacterias comensales y patógenas y se han relacionado con la salud y la enfermedad intestinal35,36. Se ha demostrado que los autoinductores sintetizados por bacterias comensales ayudan a mantener la integridad de la barrera intestinal, modulan los procesos inflamatorios y promueven la “resistencia a la colonización”37, es decir, los procesos que dependen de los microorganismos residentes que actúan contra los patógenos entéricos basándose en la competencia por los nutrientes, la exclusión metabólica, el consumo de O2, producción de bacteriocina o péptido antimicrobiano e interferencia QS38,39,40. Los patógenos bacterianos utilizan sus autoinductores para coordinar la expresión de factores de virulencia e influir en la respuesta del huésped41. Además, los patógenos bacterianos pueden espiar las moléculas de señalización derivadas del huésped y del comensal para orientarse espacialmente y optimizar la expresión de virulencia en el sitio de la infección38,42. En este trabajo, mostramos que en Shigella concentraciones submilimolares de XcDSF y BDSF, dos señales de detección de quórum que pertenecen a la familia DSF, pueden provocar una disminución significativa de la transcripción de virB (Fig. 1). En particular, nuestras observaciones (Figs. 2, 3, 5) indican que esto depende de la inhibición mediada por XcDSF o BDSF de la activación de VirF del promotor del gen virB resultante de la interacción directa de las dos moléculas de DSF con la propia proteína VirF. Además, basándose en análisis de modelos moleculares, proponemos un mecanismo en el que la unión de XcDSF o BDSF a la proteína VirF provoca el cambio de la hélice α3 de VirF a una posición que ya no permite la dimerización (Fig. 4). Por último, los resultados de los ensayos de infección por Shigella de células epiteliales Caco-2 indican que la supresión de la actividad VirF mediada por XcDSF o BDSF inhibe significativamente la invasión de Shigella de las células huésped y la proliferación intracelular (Fig. 6). En conjunto, estas observaciones demuestran que XcDSF y BDSF, las dos moléculas QS más representativas de la familia DSF, ejercen un efecto antivirulencia significativo sobre Shigella. Nuestros resultados están en línea con los obtenidos previamente en S. enterica, donde otro miembro de la familia DSF, el ácido cis-2-hexadecenoico (c2-HDA o XfDSF2), se une a la proteína HilD, principal regulador transcripcional de Salmonella, impidiendo su dimerización y actividad para promover la transcripción y, por tanto, patogenicidad de Salmonella15. VirF y HilD pertenecen a la misma subclase de proteínas de la familia AraC-XylS43 y comparten el mecanismo inhibidor mediado por la unión de ácidos grasos11,44. Dado esto, y en base a los resultados de este trabajo, podemos especular que otros compuestos de la familia DSF pueden ser candidatos como inhibidores de VirF, HilD e incluso de otras proteínas de la misma subfamilia AraC-XylS, incluyendo ToxT en Vibrio cholerae y Rns en E. coli enterohemorrágica (ETEC). Sin embargo, considerando que la inhibición parece estar influenciada por la longitud de la cadena alifática de los compuestos DSF (Bosire et al.14), y basándose en las diferencias en la capacidad inhibidora de los ácidos grasos de HilD y VirF (por ejemplo, ácido palmitoleico)11 ,14, la inhibición de las moléculas DSF de las proteínas AraC-XylS citadas puede no ser completamente comparable. Aunque las interacciones descritas hasta ahora entre los principales reguladores de los mecanismos de virulencia de los enteropatógenos típicamente humanos sugieren que las moléculas DSF están presentes en el intestino humano, esto todavía es objeto de debate. Sin embargo, alguna evidencia adicional apoya esta presencia. En particular, la identificación del productor de DSF Stenotrophomonas maltophilia como parte de la microbiota central específica de la cripta del intestino del ratón45,46 y la evaluación del ácido cis-2-hexadecenoico (c2-HDA) como una de las moléculas más abundantes en el fracción de ácidos grasos del contenido colónico del ratón15, muestran que los DSF están presentes en el intestino del ratón y sugieren que también pueden estar presentes en el intestino de otros mamíferos, incluidos los humanos. Además, las predicciones in silico han demostrado la existencia de circuitos genéticos DSF en muchos microorganismos intestinales humanos47,48. En conclusión, dada la probable presencia de DSF en el intestino humano, podemos especular que los DSF pueden contribuir a la "resistencia a la colonización" al inhibir la virulencia de patógenos como V. cholerae, S. enterica y S. flexneri15. Alternativamente, los DSF podrían participar en el ajuste fino de la expresión de virulencia en enteropatógenos al prevenir la expresión completa de los sistemas de virulencia en la luz intestinal, donde los DSF podrían estar presentes en niveles más altos, y permitir su expresión a medida que la bacteria se acerca a la mucosa intestinal, donde la virulencia Los compuestos están presentes en concentraciones más bajas12. En este sentido, es interesante señalar que cuando Shigella se acerca a la mucosa intestinal, además de experimentar una disminución en la concentración de moléculas de DSF, lo que lleva a una desrepresión de la virulencia, también percibe un aumento de la oxigenación en función de la presencia de la red capilar en la mucosa. Esto conduce a la activación completa del T3SS, aumentando así la virulencia49. Por tanto, podemos plantear la hipótesis de que la dilución de las moléculas de DSF y el aumento de oxígeno cooperan para optimizar la expresión de la virulencia de Shigella en el sitio de acción correcto. En general, la caracterización de la interacción entre las moléculas VirF y DSF puede contribuir al desarrollo racional de compuestos innovadores que exhiban actividad antivirulencia al atacar específicamente la virulencia bacteriana sin interferir con el crecimiento celular. Esto podría proporcionar estrategias terapéuticas distintas al uso de antibióticos en el tratamiento de la shigelosis, frenando así el alarmante aumento de cepas de Shigella resistentes a los antibióticos aisladas en los últimos años50.

Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla S1. Las células bacterianas se cultivaron aeróbicamente en medio Luria-Bertani (LB) (Sigma-Aldrich) a 37 °C y, cuando fue necesario, se agregaron antibióticos en las siguientes concentraciones finales: ampicilina 100 μg/mL; kanamicina 30 µg/ml; estreptomicina 10 μg/ml. Para evaluar el efecto de XcDSF y BDSF (Sigma-Aldrich) sobre el crecimiento bacteriano, se obtuvo una solución al 5% de estos compuestos calentando el tubo a 37 °C y agitándolo en el baño ultrasónico. Luego esta solución se diluyó hasta las concentraciones finales indicadas en medio LB, cuidando de mantener constante la concentración de DMSO (4%) en cada muestra. Para realizar los otros experimentos in vivo e in vitro, utilizamos una solución al 2% de XcDSF o BDSF en DMSO que luego se diluyó en LB, o en un tampón exclusivo, hasta una concentración final del 0,02%. Las secuencias de oligonucleótidos, diseñadas en base al genoma M90T, se informan en la Tabla S2. Las reacciones de PCR se realizaron de forma rutinaria utilizando la ADN polimerasa DreamTaq (Thermo Fisher Scientific) o, cuando se requirió una mayor fidelidad del producto de PCR, la ADN polimerasa Ex Taq (Takara). Los plásmidos utilizados en este trabajo se enumeran en la Tabla S3.

La purificación del ARN bacteriano se realizó como se describió anteriormente51 y la síntesis de ADNc se obtuvo con el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). Brevemente, se trataron 1,5 μg de ARN total de bacterias con ADNasa I y luego se retrotranscribieron en una mezcla de reacción de 20 μl siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (qRT-PCR) se realizó en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus™ (Applied Biosystem). El volumen de reacción fue de 20 μl que contenía Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem), 2 μl de muestra de ADNc y oligos específicos para los genes virF, virB, icsA y nusA (300 nM cada uno), este último utilizado como control endógeno. . Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 1 ciclo a 95 °C durante 2 min, 40 ciclos a 95 °C durante 10 s seguido de 60 °C durante 30 s. El análisis cuantitativo de las transcripciones se basó en el método 2-ΔΔCt52, y los resultados se indican como "expresión relativa" con respecto a la muestra de referencia. Todos los pares de oligo utilizados para qRT-PCR, diseñados con el software Primer Express v2.0, se informan en la Tabla S2 y se validaron experimentalmente.

Los sedimentos de bacterias se resuspendieron en PBS con tampón de muestra final (FSB) 1X y, después de hervir a 100 °C, se cargaron en SDS-PAGE al 12,5 %. En cada ejecución de electroforesis se incluyó un marcador de peso molecular de proteína (regla de páginas; Thermo Fisher). Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond-P, Millipore) y la inmunotransferencia se realizó con anticuerpo monoclonal ANTI-FLAG® M2 (Sigma-Aldrich) y anti-OmpA53,54 policlonal de conejo como anticuerpos primarios, y anti-OmpA53,54 de cabra conjugado con HRP. -anticuerpos IgG anti-conejo y de ratón como anticuerpos secundarios (Sigma-Aldrich). Las señales se produjeron con ECL Star (Euroclone) y se detectaron con ChemiDoc™ Gel Imaging System (Bio-Rad Laboratories). El análisis densitométrico se realizó mediante el software ImageJ55.

Se diluyeron cultivos nocturnos de E. coli XL1BLUE pMALcF1 100 veces en 1 l de medio LB que contenía glucosa al 0,2 % y se incubaron a 37 °C. La glucosa era necesaria para reprimir los genes cromosómicos de la maltosa y prevenir la expresión de amilasa y, por tanto, la degradación de la amilosa en la resina de afinidad. Cuando la densidad del cultivo alcanzó una DO600 de 0,5, se añadió IPTG 0,3 mM para inducir la transcripción del gen malE-virF y la incubación continuó durante 4 h adicionales a 37 °C. Las células recolectadas por centrifugación se resuspendieron en 10 ml de tampón A (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM y NaCl 200 mM). Las células resuspendidas se rompieron mediante sonicación en hielo y se centrifugaron a 12.000 rpm a 4 ° C durante 20 minutos para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se diluyó cinco veces con tampón A y se cargó en una columna de 5 ml de resina de amilosa (New England Biolabs) preequilibrada en tampón A a un caudal de 1 ml/min. La columna se lavó con 40 ml de tampón A y la proteína de fusión se eluyó con 20 ml de tampón A que contenía maltosa 10 mM. Las fracciones que contenían MalE-VirF, a juzgar por el análisis SDS-PAGE, se combinaron, se lavaron (para eliminar la maltosa) y se concentraron con dispositivos de filtrado con MWCO de 50 KDa (Millipore). La concentración de proteína se calculó utilizando un coeficiente de extinción teórico a 280 nm de 89.730 M-1 cm-1 (calculado con la herramienta Expasy ProtParam).

El ensayo DPIPA11 utiliza la superficie de fondo plano recubierta de dextrina de los pocillos de microplacas de poliestireno (Nunc MaxisorpTM, Thermo Fisher Scientific) como matriz sólida para la adsorción por afinidad de la proteína MalE-VirF. Luego se usó para medir la cantidad del fragmento de ADN de PvirB que comprende el sitio de unión de VirF proximal en la secuencia del promotor de virB y se obtuvo mediante amplificación por PCR usando el par de oligos pvirB_F FITC/pvirB_R FITC y el plásmido pBN1 como plantilla. Brevemente, se trataron 96 pocillos de placa con 150 µl de dextrina al 0,5% peso/vol de almidón de maíz (Sigma-Aldrich) disuelta en tampón fosfato de sodio 100 mM, pH 7 (PBS), durante la noche a 4 °C en una cámara húmeda. Luego, los pocillos se bloquearon durante 1 h con 150 µl de albúmina sérica bovina (BSA) al 1,5% en PBS a 37 °C. Después de lavar con PBS, 50 µl de solución tampón de unión (Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, DTT 1 mM, NaCl 50 mM, NP-40 al 0,1%) que contiene 1 µM de proteína MalE-VirF, 75 ng de PCR marcada con FITC Se agregaron fragmentos de ADN y, cuando fue necesario, XcDSF o BDSF al 0,02% a los pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación suave. Finalmente, se eliminó el sobrenadante y se detectó la fluorescencia del ADN unido con el lector de microplacas CLARIOstar (BMG LABECH, Offenburg, Alemania).

Los procedimientos de modelado y acoplamiento se realizaron como ya se describió11. Brevemente, el modelo dimérico de VirF se obtuvo utilizando AlphaFold2 (versión 2.0.1)56 con el regulador transcripcional homólogo basado en plantilla Rns (https://www.rcsb.org/; número de acceso de PDB 6XIU; porcentaje de identidad, 41 % )13. El acoplamiento de DSF al sitio activo se realizó utilizando el software Molegro Virtual Docker (MVD) v7.0 (Molexus). La unión al ADN de VirF se predijo utilizando como plantilla la estructura de Mar-A (PDB: 1XS954). El modelado y análisis de estructuras se realizaron utilizando PyMod 3.057. Las transiciones conformacionales de VirF entre las conformaciones abierta y cerrada se obtuvieron utilizando el modelo de red elástica, implementado en PyANM58, con valores predeterminados.

Los experimentos de infección se realizaron utilizando líneas celulares Caco-2 como se describió anteriormente59. Se cultivaron células epiteliales Caco-2 humanas (American Type Culture Collection, Manassas, VA) a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 en DF10, que comprende 10% de suero bovino fetal FBS (FBS) inactivado por calor, 2 mM l. -glutamina y solución de penicilina-estreptomicina (PS) al 10% (Sigma-Aldrich) en medio esencial modificado por Dulbecco (DMEM) (GIBCO). Para la infección bacteriana, las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos (Falcon), a una densidad de 4 x 105 células/pocillo, en DF10. Después de 24 h, las células se privaron de suero durante la noche en un medio DF10 modificado con FBS al 0,5% (DF0,5). DF0.5 se reemplazó con DMEM nuevo que contenía solo l-glutamina 2 horas antes de la infección bacteriana. La línea celular se infectó a una MOI de 100. Después de la adición de bacterias no tratadas y tratadas con XcDSF o BDSF al 0,02%, las placas se centrifugaron durante 15 minutos a 750 xg y se incubaron durante 45 minutos a 37 °C en una atmósfera de 5%. Atmósfera de CO2 para permitir la entrada de bacterias. Posteriormente, las bacterias extracelulares se eliminaron mediante lavado completo con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Este punto fue considerado como tiempo cero (T0). Se añadió medio DMEM nuevo que contenía gentamicina (100 μg/ml) a cada placa para matar las bacterias extracelulares y las células infectadas se incubaron a 37 °C durante hasta 4 h. Para calcular el número de bacterias intracelulares para todos los tiempos de infección, se lisaron las células y se recuperaron las bacterias, se lavaron con NaCl al 0,9 % y se diluyeron en serie en agar LB. El porcentaje de bacterias que penetraron en las células epiteliales Caco-2 se calculó comparando las UFC/ml en el momento T0 con las obtenidas sembrando en placas la carga bacteriana utilizada para infectar las células epiteliales (es decir, el control bacteriano previo a la infección). La supervivencia bacteriana se analizó calculando las UFC/ml obtenidas durante 4 h pi (T0-T4).

La significancia estadística se determinó con la prueba t de Student de dos colas en experimentos de RT-PCR, análisis densitométrico de Western Blot y DPIPA. Se utilizó el análisis de varianza bidireccional (ANOVA) para calcular la significación estadística de los resultados con respecto a la capacidad de invasión de Shigella en células Caco-2.

Los conjuntos de datos analizados durante este estudio están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Agradecemos a Isabel Delany por su valiosa revisión de este artículo.

La financiación fue apoyada por el Ministerio italiano de Asuntos Exteriores y Cooperación Internacional, JP21GR04, Universidad Sapienza de Roma.

Instituto Pasteur Italia, Departamento de Biología y Biotecnologías “Charles Darwin”, Universidad La Sapienza de Roma, p.le Aldo Moro 5, 00185, Roma, Italia

Rita Trirocco, Martina Pasqua, Bianca Colonna y Gianni Prosseda

Instituto de Biología y Patología Molecular, Consejo Nacional de Investigación, Roma, Italia

Angela Tramonti

Departamento de Ciencias Bioquímicas, Universidad La Sapienza de Roma, p.le Aldo Moro 5, 00185, Roma, Italia

Alessandro Paiardini

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Conceptualización, GP, RT; metodología, investigación, análisis formal y curación de datos, GP, RT, AT, AP, MP; redacción del borrador original, GP, BC, AP, MP, revisión y edición de la redacción, BC, GP; Administración del proyecto, GP, BC Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Gianni Prosseda.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Trirocco, R., Pasqua, M., Tramonti, A. et al. Los factores de señal difusibles (DSF) se unen y reprimen a VirF, el principal activador de virulencia de Shigella flexneri. Representante científico 13, 13170 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40023-w

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Recibido: 29 de mayo de 2023

Aceptado: 03 de agosto de 2023

Publicado: 14 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40023-w

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