Honokiol induce la apoptosis

Parásitos y vectores volumen 16, número de artículo: 287 (2023) Citar este artículo

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Cryptocaryon irritans, un parásito común en los peces teleósteos marinos tropicales y subtropicales, ha causado graves daños a la industria de la acuicultura marina. En nuestro estudio anterior se demostró que Honokiol induce la contracción y muerte del citoplasma de C. irritans tomont, pero el mecanismo por el cual funciona sigue siendo desconocido.

En este estudio, los cambios de la morfología apoptótica y la proporción apoptótica se detectaron mediante observación microscópica y tinción con AnexinaV-FITC/PI. Los efectos del honokiol sobre la concentración de calcio intracelular ([Ca2+]i), el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), las especies reactivas de oxígeno (ROS), la cantidad de fragmentaciones de ADN (QDF) y las actividades de caspasa se detectaron mediante tinción con Fluo-3, JC-1. tinción, tinción DCFH-DA, método Tunel y kit de ensayo de actividad caspasa. Los efectos del honokiol sobre los niveles de expresión de ARNm de 61 genes relacionados con la apoptosis en tomonts de C. irritans se detectaron mediante PCR en tiempo real.

Los resultados del estudio sobre los efectos de la concentración de honokiol en la muerte por apoptosis de C. irritans tomont mostraron que los niveles más altos de tasa de muerte por apoptosis en profase (PADR), concentración de [Ca2+]i, ROS, las actividades de caspasa-3 /9 y el índice de necrosis (NER) más bajo se obtuvieron a una concentración de 1 μg/ml, que se consideró la más adecuada para inducir una muerte similar a la apoptosis de C. irritans tomont. Cuando se trataron tomonts de C. irritans con 1 μg/ml de honokiol, la concentración de [Ca2+]i comenzó a aumentar significativamente al cabo de 1 h. Después de esto, las ROS, QDF y las actividades de caspasa-3/9 comenzaron a aumentar significativamente, y el ΔΨm comenzó a disminuir significativamente a las 2 h; la PADR más alta se obtuvo a las 4 h. La expresión de ARNm de 14 genes aumentó significativamente durante el tratamiento con honokiol. De estos genes, itpr2, capn1, mc, actg1, actb, parp2, traf2 y fos se enriquecieron en la vía relacionada con la apoptosis inducida por el estrés del retículo endoplásmico (RE).

Este artículo muestra que el honokiol puede inducir una muerte similar a la apoptosis de C. irritans tomont. Estos resultados sugieren que el honokiol puede alterar la homeostasis de [Ca2+]i en ER y luego inducir una muerte similar a la apoptosis de C. irritans tomont por cascada de caspasas o vía mitocondrial, lo que podría representar una nueva intervención terapéutica para la infección por C. irritans.

Cryptocaryon irritans, un parásito protozoario común de los peces teleósteos marinos, causa la enfermedad de la “mancha blanca” [1]. Esta enfermedad prevalece principalmente en zonas marinas tropicales y subtropicales [2,3,4]. Su ciclo de vida incluye cuatro etapas: trofonte, protomonto, tomont y theront [5]. Tomont es la etapa de vida libre y más duradera de C. irritans. Los tomonts tienen una fuerte resistencia a las drogas y a los ambientes hostiles debido a sus quistes duros. Los tomonts todavía pueden producir theronts infecciosos después de ser conservados a 12 °C durante 3 meses [5]. Es difícil eliminar completamente los tomonts de C. irritans en un entorno de maricultura abierto, lo que dificulta mucho la prevención y el control de la enfermedad de la mancha blanca. Es una buena estrategia para prevenir y tratar los parásitos induciendo su muerte espontánea; esto tiene las ventajas de una baja probabilidad de resistencia a los medicamentos e inflamación del huésped. Es bien sabido que la apoptosis es un proceso de muerte celular altamente regulado [6]. En los últimos años, la apoptosis ha proporcionado un nuevo tratamiento para muchas enfermedades, como la inflamación, el cáncer, la leishmaniasis, la malaria y la toxoplasmosis [7,8,9,10,11,12,13,14]. La vía de muerte similar a la apoptosis también se ha encontrado en muchos protozoos, como Leishmania, Plasmodium falciparum, Tetrahymena thermophila, Trypanosoma cruzi, Blastocystis hominis, Toxoplasma gondii e Ichthyophthirius multifiliis [12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21], proporcionando una nueva forma de tratar enfermedades parasitarias. Se han encontrado muchos genes de C. irritans relacionados con la apoptosis mediante análisis del transcriptoma [22,23,24,25,26], lo que indica que C. irritans podría tener una vía de muerte similar a la apoptosis. Se ha informado que el honokiol, uno de los principales componentes activos de Magnolia officinalis, induce la apoptosis de células cancerosas y Candida albicans a través de la vía de estrés del retículo endoplásmico (RE) [27,28,29,30]. Nuestros estudios previos demostraron que el honokiol inhibía significativamente la proliferación y la eclosión de tomonts de C. irritans. El citoplasma resultante de C. irritans tomont obviamente se redujo sin dañar el citoplasma ni la membrana celular [31], lo que indica que el honokiol podría inducir una muerte similar a la apoptosis de C. irritans tomont. Sin embargo, se necesitan más experimentos para confirmar esta especulación y el mecanismo aún no se ha descubierto.

En este artículo, se utilizó la tinción con anexina V-FITC/PI para determinar si el honokiol induce una muerte similar a la apoptosis de C. irritans tomont. Los efectos del honokiol en diversas concentraciones y tiempos de tratamiento sobre las morfologías, tasa normal (NOR), tasa de muerte similar a la apoptosis en profase (PADR), tasa de muerte similar a la apoptosis en anafase (AADR), tasa de necrosis (NER), concentración de calcio intracelular ( [Ca2+]i), el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), las especies reactivas de oxígeno (ROS), la cantidad de fragmentaciones de ADN (QDF), las actividades de caspasa y la expresión de ARNm de genes relacionados con la apoptosis de C. irritans tomont se investigaron para descubrir la Mecanismo del honokiol para inducir la muerte similar a la apoptosis de C. irritans tomont.

Trachinotus ovatus, con un peso de 80,0 ± 10,6 g, se adquirió de un cultivo en jaulas marinas, condado de Lingshui, provincia de Hainan, República Popular China. Los peces se remojaron en agua de mar que contenía 1 ml/l de formaldehído durante 10 minutos y se aclimataron en acuarios de 2000 l durante 21 días (diámetro = 2 m, altura = 1 m) equipados con aireadores y un sistema de flujo de agua (profundidad del agua 0,6 m). , temperatura del agua 29,0 ± 2,0 ℃, pH 7,8 ± 0,2, salinidad 30 ± 0,5, oxígeno disuelto [DO] 6,8 ± 0,1 mg/l). Los peces fueron alimentados con alimento para peces marinos (Zhongshan President Enterprises Co., Ltd., RP China) al 4% del peso corporal tres veces (9:00, 16:00 y 22:00) todos los días.

Honokiol con una pureza de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) ≥ 98% se adquirió de Century Aoke Biological Technology Co., Ltd. (PR China). Se disolvió una cantidad de 250 mg de honokiol en 25 ml de solución acuosa de etanol al 50 % (v/v) y se diluyó a 800, 400, 200, 100, 60 y 0 (muestra de control) µg/ml con 50 % (v/v). v) solución acuosa de etanol.

Los Cryptocaryon irritans utilizados en este estudio se aislaron de T. ovatus con enfermedad de la mancha blanca, que se obtuvieron de un cultivo en jaulas marinas en el condado de Lingao, provincia de Hainan, República Popular China, y se pasaron y propagaron en T. ovatus [31]. Todos los tomonts de C. irritans utilizados en este estudio se recolectaron recientemente entre las 8:00 am y las 9:00 am del día del experimento.

Se recogieron tomonts de Cryptocaryon irritans, se resuspendieron en 1 ml de agua de mar esterilizada con filtro y se agregaron a los pocillos asignados en una microplaca de 24 pocillos. Luego, se agregaron 10 µl de soluciones acuosas de etanol 0 (muestra de control), 60, 100, 200, 400 y 800 µg/ml de honokiol al 50 % (v/v) a los pocillos asignados en las microplacas de 24 pocillos, respectivamente. Las concentraciones finales de honokiol fueron 0,0 (muestra de control), 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 y 8,0 μg/ml, respectivamente. Las microplacas de 24 pocillos se colocaron en una incubadora ligera (GZX250E, Tianjin Taisite Instrument Co., Ltd., PR China) a 27 ± 0,5 °C durante 8 h. Las morfologías, NOR, PADR, AADR, NER, concentración de [Ca2+]i, ΔΨm, ROS, QDF y actividades de caspasa de los tomonts de C. irritans tratados anteriormente se analizaron utilizando un método de observación microscópica directa, un Anexina V-FITC/ Kit de detección de apoptosis PI, un kit de detección de concentración de calcio Fluo-3 AM, un kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial, un kit de ensayo de especies reactivas de oxígeno, un kit de ensayo de apoptosis de marcado de extremo de mella dUTP con desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL) y un kit de caspasa-3/ Kit de ensayo de actividad 8/9, respectivamente. Los tomonts de Cryptocaryon irritans se trataron con honokiol en la concentración óptima de acuerdo con los resultados de los experimentos anteriores durante 0, 1, 2, 4, 8 y 16 h. Sus morfologías, NOR, PADR, AADR, NER, concentración de [Ca2+]i, ΔΨm, ROS, QDF y actividades de caspasa también se analizaron utilizando los mismos métodos mencionados anteriormente. Los tomonts de Cryptocaryon irritans se trataron con honokiol en las condiciones con la mayor tasa de apoptosis de los tomonts de acuerdo con los resultados de los experimentos anteriores, y luego se observó la tasa de inhibición de la eclosión de los tomonts de acuerdo con el método descrito por Zhong et al. [31]. Cada pocillo asignado al análisis de la actividad de caspasa y al análisis de la expresión de ARNm de genes relacionados con la apoptosis contenía 1000 tomonts de C. irritans, mientras que cada pocillo asignado a los otros análisis contenía 100 tomonts de C. irritans. Cada análisis se llevó a cabo cinco veces en paralelo.

Se analizaron NOR, PADR, AADR y NER de tomonts de C. irritans utilizando un kit de detección de apoptosis con anexina V-FITC/PI (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., PR China). Los tomonts de C. irritans, tratados como se describe en "Diseño del experimento", se lavaron dos veces con 1 ml de PBS enfriado con hielo (pH = 7,4, 0,01 mol/l) y se resuspendieron en 100 µl de tampón de unión. Se añadió una solución de 5 μl de Anexina V-FITC y los tomonts se incubaron a 27 ± 0,5 ℃ en la oscuridad durante 10 min. Luego, se añadió una solución de 5 µl de PI y los tomonts se incubaron a 27 ± 0,5 ℃ en la oscuridad durante 5 minutos, se lavaron dos veces con 1 ml de PBS enfriado con hielo y se transfirieron a microplacas de 384 pocillos (cada pocillo contenía un C. irritans tomont). Se analizaron un total de 150 tomonts de C. irritans en paralelo con un lector de microplacas de fluorescencia (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc., EE. UU.) a Ex/Em = 488/525 nm y Ex/Em = 488/630 nm, y sus micromorfologías se observaron bajo un microscopio de inversión de fluorescencia (DMi8 + DFC7000T, Leica Microsystems, Alemania). Se dibujaron diagramas de apoptosis de cuatro cuadrantes utilizando una intensidad de fluorescencia de Anexina V-FITC transformada con logaritmos [LG (A Ex/Em = 488/525 nm)] como eje de abscisas y una intensidad de fluorescencia de PI transformada con logaritmos [LG (A Ex/Em = 488/630 nm)] como eje de ordenadas. Los tomonts de C. irritans se identificaron de acuerdo con los cuatro cuadrantes normales (en el cuadrante I), muerte tipo apoptosis en profase (en el cuadrante II), muerte tipo apoptosis en anafase (en el cuadrante III) y necrosis (en el cuadrante IV). Se registraron diagramas de apoptosis de cuadrantes y sus números [28]. Finalmente se calcularon los porcentajes de los tomonts NOR, PADR, AADR, NER y C. irritans.

Las concentraciones de [Ca2+]i en tomonts de C. irritans se determinaron utilizando un kit de detección de concentración de calcio Fluo-3 AM (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., PR China). Los tomonts de C. irritans, tratados como se describe en "Diseño del experimento", se lavaron dos veces con 1 ml de PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) y se incubaron en 200 µl de mezcla de reacción Fluo-3 AM (5 µmol/l) a 27 ± 0,5 ℃ en la oscuridad durante 20 min. Luego, se añadió 1 ml de suero bovino fetal al 1%-solución salina equilibrada de Hank (HBSS, pH = 7,4, 0,01 mol/l) y los tomonts se incubaron a 27 ± 0,5 ℃ en la oscuridad durante 40 min, se lavaron dos veces con 1 ml de tampón de ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]etanosulfónico (HEPES, pH = 7,4, 0,01 mol/l), y se resuspendió en 100 μl de HEPES a 27 ± 0,5 ℃ en la oscuridad durante 10 min. La intensidad de la fluorescencia se determinó utilizando un lector de microplacas de fluorescencia (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc., EE. UU.) a Ex/Em = 488/525 nm. Los resultados se expresaron como la intensidad de fluorescencia total por 100 tomonts de C. irritans.

El ΔΨm en tomonts de C. irritans se determinó utilizando un kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial con JC-1 (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., PR China). Los tomonts de C. irritans se trataron con cianuro de carbonilo 3-clorofenilhidrazona (CCCP, 10 μmol/l) durante 20 minutos como control positivo. Los tomonts de C. irritans, tratados como se describe en "Diseño del experimento" y con CCCP, se lavaron dos veces en 1 ml de PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l), se incubaron en 10 µg/ml de mezcla de reacción JC-1 durante 20 minutos. a 27 ± 0,5 ℃ en la oscuridad, se lavó dos veces con 1 ml de solución tampón JC-1 (1 x) y se resuspendió en 100 µl de tampón de unión JC-1 (1 x). La intensidad de la fluorescencia se determinó utilizando un lector de microplacas de fluorescencia (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc., EE. UU.) a Ex/Em = 490/530 nm y Ex/Em = 525/590 nm. Los resultados se expresaron como la tasa de potencial de membrana mitocondrial de polímero a monómero (polímero/monómero) por 100 tomonts de C. irritans [32].

La acumulación de ROS en tomonts de C. irritans se determinó mediante un kit de ensayo de especies reactivas de oxígeno (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., PR China). Los tomonts de C. irritans, tratados como se describe en "Diseño del experimento", se lavaron dos veces en 1 ml de PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l), se incubaron en 200 µl de diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA, 10 μmol/l) se mezcló de reacción a 27 ± 0,5 ℃ en la oscuridad durante 20 min, se lavó dos veces en 1 ml de PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) y se resuspendió en 100 μl de PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l). l). La intensidad de la fluorescencia se determinó utilizando un lector de microplacas de fluorescencia (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc., EE. UU.) a Ex/Em = 488/525 nm. Los resultados se expresaron como la intensidad de fluorescencia total por 100 tomonts de C. irritans.

El QDF en tomonts de C. irritans se determinó utilizando un kit de ensayo de apoptosis TUNEL (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., PR China). Los tomonts de C. irritans, tratados como se describe en “Diseño del experimento”, se lavaron dos veces en 1 ml de PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l), se fijaron en 200 µl de paraformaldehído al 4% (p/v) a temperatura ambiente durante 30 minutos. min, se lavó tres veces en 1 ml de PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l), se permeabilizó con 200 μl de Triton-PBS al 0,01 % (pH = 7,4, 0,01 mol/l) en hielo durante 2 min, se lavó dos veces en 1 ml PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l), y se incubaron en 100 μl de mezcla de reacción TUNEL (1 ×) a 27 ± 0,5 ℃ en la oscuridad durante 60 min, se lavaron dos veces en 1 ml de PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l). l), y se resuspendió en 100 µl de PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l). La intensidad de la fluorescencia se determinó utilizando un lector de microplacas de fluorescencia (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc., EE. UU.) a Ex/Em = 550/590 nm. Los resultados se expresaron como la intensidad de fluorescencia total por 100 tomonts de C. irritans.

Las actividades de las caspasas, incluida la caspasa-3/8/9 en los tomonts de C. irritans, se determinaron respectivamente utilizando un kit de ensayo de actividad de caspasa-3/8/9 (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., PR China) . En hielo, los tomonts de C. irritans, tratados como se describe en "Diseño del experimento", se lavaron dos veces en 1 ml de PBS helado (pH = 7,4, 0,01 mol/l), se añadió un tampón de lisis en una proporción de 1: 10 (masa de C. irritans tomonts: tampón de lisis, g:ml), se molió para homogeneizar en hielo usando una varilla de molienda, se partió en hielo durante 15 min y se centrifugó (15000 g, 4 ℃, 15 min). Luego se recogieron los sobrenadantes. Los sobrenadantes, el tampón de reacción de caspasa y los sustratos (Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilida para la determinación de la actividad de caspasa-3, N-acetil-Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroanilida para la determinación de la actividad de caspasa-8, y Leu-Glu-His-Asp-p-nitroanilida para la determinación de la actividad de caspasa-9) se agregaron a placas de enzimas de 96 pocillos y se incubaron a 37 ℃ durante 8 h, determinado mediante un lector de microplacas (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc. , EE. UU.) a 405 nm. Las actividades de caspasa-3/8/9 se calcularon utilizando la siguiente función:

donde X es el resultado del cálculo de la absorbancia a 405 nm en la curva estándar de caspasa (μmol/l), V1 es el volumen total del sistema de reacción (μl), V2 es el volumen del sobrenadante añadido (μl), T es el tiempo de reacción (h) y Cprotein es la concentración de proteína total en el sobrenadante (mg/ml) determinada por el método de Bradford [33].

Los tomonts de C. irritans se trataron con honokiol a la concentración óptima obtenida según los resultados del diseño del experimento durante 0, 1, 2, 4, 8 y 16 h, y se evaluó la expresión de ARNm de los 61 genes relacionados con la apoptosis obtenida por blastocito. según el genoma de C. irritans (SRX12890364, SRX12890363) [34] se analizó mediante el método RT-PCR. Cada pocillo asignado a la expresión de ARNm del análisis de genes relacionados con la apoptosis contenía 1000 tomonts de C. irritans. Cada análisis se realizó por triplicado. Los 61 genes relacionados con la apoptosis y sus cebadores diseñados por el software Primer 3 plus (https://www.primer3plus.com/) de acuerdo con las reglas de diseño de cebadores [70] se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S1. Las especificidades de los cebadores utilizados en este estudio se confirmaron mediante la herramienta BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Se usó Eastep Super Total RNA Extraction LS1040 (Promega Corp., EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para extraer el ARN total mediante el homogeneizador de tejido de vidrio de los tomonts de C. irritans tratados, y se usó DNasa I (Promega Corp., EE. UU.) para digerir el ADN contaminante. Luego, se utilizaron electroforesis en gel de agarosa y un espectrofotómetro ultramicro (NanoPhotometer NP80, IMPLEN GMBH, Alemania) para garantizar la calidad del ARN, y la secuencia de ADNc se sintetizó utilizando el kit Eastep RT Master MIX LS2054 (Promega Corp., EE. UU.). Las expresiones de ARNm se detectaron utilizando el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) con una mezcla de reacción de 10 μl que contenía 5 μl (2 ×) de Eastep qPCR Master Mix (Vazyme Biotech Co., Ltd. , República Popular China), 1,0 µl de plantilla de ADNc, 0,2 µl de cada cebador (10 µmol/l) y 3,6 µl de agua libre de nucleasas. Cada muestra se analizó por triplicado. Las condiciones de ciclo de PCR en tiempo real fueron las siguientes: 120 s 95 °C desnaturalización inicial, 40 ciclos de 15 s 95 °C desnaturalización y 60 s 60 °C recocido/extensión. Se realizó un análisis de la curva de disociación (65 a 95 °C: incremento de 0,5 °C durante 5 s) para verificar la amplificación de un solo producto. La secuencia del gen C. irritans 18S rRNA (JN636814.1) se utilizó como gen de referencia interna. Además, las especificidades de los cebadores se confirmaron mediante la curva de fusión cuantitativa de fluorescencia utilizada en el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Después de la PCR en tiempo real, la expresión de ARNm de los genes relacionados con la apoptosis se calculó mediante el método de 2−△△Ct.

Todos los índices experimentales se probaron utilizando la prueba de Tukey con SPSS 25.0 (IBM Corp., EE. UU.) para determinar la diferencia significativa entre la muestra experimental y la muestra de control. Se consideró una diferencia significativa cuando los valores de p fueron <0,05 y extremadamente significativa cuando los valores de p fueron <0,01. El gráfico se trazó utilizando OriginPro 9.0 (OriginLab Corp., EE. UU.) y los datos se expresaron como media ± desviación estándar (DE).

Las morfologías de los tomonts de C. irritans no teñidos y teñidos con Anexina V-FITC/PI tratados con honokiol se muestran en la Fig. 1, lo que muestra que todos los citoplasmas de los tomonts de C. irritans tratados con honokiol obviamente se contrajeron, sus membranas celulares se separaron de los quistes. , y se tiñeron con Anexina V-FITC (que muestra fluorescencia verde) de manera dosis dependiente; esto indica fosfatidilserina valgo en la membrana celular (una característica típica de la apoptosis celular). Cuando la concentración de honokiol fue > 4,0 μg/ml, los citoplasmas de C. irritans tomonts tratados se condensaron irregularmente, se volvieron hialinos y se tiñeron con PI (mostrando fluorescencia roja), lo que indica que sus membranas celulares estaban dañadas (una característica típica de apoptosis o necrosis celular en etapa media y tardía). En la Fig. 2 se muestran diagramas de apoptosis de cuatro cuadrantes, que muestran que con el aumento de honokiol, la PADR comenzó a aumentar a una concentración de 0,6 μg/ml. Alcanzó su nivel más alto cuando la concentración de honokiol fue de 1,0 μg/ml y luego disminuyó, mientras que la AADR y la NER comenzaron a aumentar a una concentración de 2,0 μg/ml.

Morfologías de tomonts de Cryptocaryon irritans tratados con honokiol teñidos y sin teñir con anexina V-FITC/PI. Los tomonts de C. irritans se trataron con honokiol a 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 y 8,0 μg/ml durante 8 h. Los tomonts tratados se incubaron con Anexina V-FITC y una sonda de PI y se observaron bajo un microscopio de inversión de fluorescencia (DMi8 + DFC7000T, Leica Microsystems, Alemania). Los resultados muestran que todos los citoplasmas de C. irritans tomonts tratados con honokiol obviamente se redujeron y se tiñeron con Anexina V-FITC. Cuando la concentración de honokiol era > 4,0 μg/ml, los citoplasmas de C. irritans tomonts tratados se condensaban irregularmente, se volvían hialinos y se tiñeban con PI. a – f: Morfologías de C. irritans tomonts tratados respectivamente con 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 y 8,0 μg/ml de honokiol durante 8 h. g–l: Morfologías de tomonts de C. irritans tratados respectivamente con 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 y 8,0 μg/ml de honokiol durante 8 h y observados a Ex/Em = 488/525 nm. m – r: Morfologías de tomonts de C. irritans tratados respectivamente con 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 y 8,0 μg/ml de honokiol durante 8 h y observados a Ex/Em = 488/630 nm. s–x: Fotografías de morfología superpuestas de tomonts de C. irritans tratados respectivamente con 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 y 8,0 μg/ml de honokiol durante 8 h y registrados a Ex/Em = 488/525 nm y Ex/Em = 488/630 nm. Todas las barras = 300 μm

Diagramas de apoptosis de cuatro cuadrantes de tomonts de Cryptocaryon irritans tratados con honokiol en diversas concentraciones durante 8 h. Los tomonts de C. irritans se trataron con honokiol a 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 y 8,0 μg/ml durante 8 h. Los tomonts tratados se incubaron con Anexina V-FITC y una sonda de PI y se analizaron con un lector de microplacas de fluorescencia (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc., EE. UU.). Los resultados muestran que con el aumento en la concentración de honokiol, la PADR comenzó a aumentar a 0,6 μg/ml y alcanzó el nivel más alto a 1,0 μg/ml, mientras que la AADR y la NER comenzaron a aumentar a 2,0 μg/ml.

La concentración de [Ca2+]i y las actividades ΔΨm, ROS, QDF y caspasa-3/8/9 en los tomonts de C. irritans tratados con honokiol en diversas concentraciones se muestran en la Fig. 3. Como se muestra en la Fig. 3A, con Al aumentar la concentración de honokiol, la concentración de [Ca2+]i aumentó a un nivel significativamente mayor que el de la muestra de control a 0,6 μg/ml. Alcanzó el nivel más alto a 1 μg/ml, volvió al nivel de la muestra de control a 2,0 μg/ml y luego disminuyó a un nivel significativamente más bajo que el de la muestra de control cuando la concentración de honokiol aumentó > 4,0 μg/ml. Como se muestra en la Fig. 3B, el ΔΨm disminuyó a un nivel significativamente más bajo que el de la muestra de control cuando la concentración de honokiol era > 0,6 μg/ml. Como se muestra en la Fig. 3C, con el aumento de la concentración de honokiol, las ROS aumentaron a un nivel significativamente mayor que el de la muestra de control a 1,0 μg/ml y luego regresaron al nivel de la muestra de control. Como muestra la Fig. 3D, con el aumento de la concentración de honokiol, el QDF comenzó a aumentar a 0,6 μg/ml, aumentó a un nivel significativamente mayor que el de la muestra de control a 1,0 μg/ml y alcanzó el nivel más alto a 2,0 μg. /ml, y luego disminuyó, pero el nivel permaneció significativamente más alto que el de la muestra de control cuando la concentración de honokiol aumentó por encima de 4,0 μg/ml. Como se muestra en la Fig. 3E, con el aumento de la concentración de honokiol, ambas actividades de caspasa-3/9 comenzaron a aumentar a niveles significativamente más altos que los de la muestra de control a 0,6 μg/ml y alcanzaron los niveles más altos a 1,0 μg/ml. ml. La actividad de caspasa-3 volvió gradualmente al nivel de la muestra de control cuando la concentración de honokiol fue ≥ 4,0 μg/ml, mientras que la actividad de caspasa-9 se mantuvo en un nivel superior al de la muestra de control, y la actividad de caspasa-3 -8 siempre permaneció al nivel de la muestra de control.

Efectos del tratamiento de 8 h con honokiol en diversas concentraciones sobre la concentración de [Ca2+]i, ΔΨm, ROS, QDF y caspasa-3/8/9 en tomonts de Cryptocaryon irritans. Los tomonts de C. irritans se trataron con honokiol a 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 y 8,0 μg/ml durante 8 h, y se midieron la concentración de [Ca2+]i, ΔΨm, ROS, QDF y caspasa-3/8/. Se determinaron 9 actividades. Los resultados muestran que la concentración de [Ca2+]i, ΔΨm, ROS y las actividades de caspasa-3/9 alcanzaron los niveles significativos más altos cuando el honokiol era 1,0 μg/ml, y el QDF alcanzó el nivel significativo más alto cuando el honokiol era 1,0 μg/ml. 2,0 µg/ml. a Efecto del honokiol sobre la concentración de [Ca2+]i en tomonts de C. irritans. b Efecto del honokiol sobre ΔΨm en tomonts de C. irritans. c Efecto del honokiol sobre las ROS en tomonts de C. irritans. d Efecto del honokiol sobre QDF en tomonts de C. irritans. e Efecto del honokiol sobre las actividades de caspasa-3/8/9 en tomonts de C. irritans. Los resultados se expresan como media ± DE, n = 5. *Diferencia significativa con respecto a la muestra de control (0,0 μg/ml), P < 0,05. **Diferencia altamente significativa con respecto a la muestra de control (0,0 μg/ml), P < 0,01

Los resultados encontrados en “Efecto del honokiol sobre la concentración de [Ca2+]i, ΔΨm, ROS, QDF y actividades de caspasa-3/8/9” mostraron que los tomonts de C. irritans tenían la mayor PADR, concentración de [Ca2+]i, ROS, actividades de caspasa-3/9, y QDF más alto, y el NER más bajo cuando la concentración de honokiol fue de 1,0 μg/ml. Por lo tanto, se consideró que 1,0 μg/ml era la concentración óptima de honokiol para inducir una muerte similar a la apoptosis de C. irritans tomont. Junto con la extensión del tiempo de tratamiento, los cambios en las actividades NOR, PADR, AADR, NER, [Ca2+]i, ΔΨm, ROS, QDF y caspasa-3/8/9 para los tomonts de C. irritans son mostrado en la Fig. 4, que muestra que, con la extensión del tiempo de tratamiento, la concentración de [Ca2+]i y PADR comenzaron a aumentar significativamente a la hora, seguidos por ROS y QDF. Las actividades de caspasa-3/9 comenzaron a aumentar significativamente y el ΔΨm comenzó a disminuir significativamente a las 2 h. Las actividades de concentración de [Ca2+]i, PADR, ROS, QDF y caspasa-3/9 alcanzaron los niveles más altos a las 4 h y luego disminuyeron ligeramente pero se mantuvieron en niveles significativamente más altos que los de las 0 h, mientras que el ΔΨm continuó disminuyendo a las 0 h. 16 h, y la AADR comenzó a aumentar significativamente a las 8 h. La NER y la actividad de caspasa-8 mostraron cambios no significativos a las 16 h. Estos resultados sugieren que el tiempo de tratamiento óptimo para 1,0 μg/ml de honokiol que induce una muerte similar a la apoptosis de C. irritans tomonts es de 4 h. La tasa de inhibición de la eclosión de tomont fue del 52,38 % después del tratamiento con 1,0 μg/ml de honokiol durante 4 h.

Efecto del tiempo de tratamiento con honokiol sobre la muerte similar a la apoptosis de Cryptocaryon irritans tomont. El tomont de C. irritans tratado con 1 μg/ml de honokiol a las 0, 1, 2, 4, 8 y 16 h y su concentración de NOR, PADR, AADR, NER, [Ca2+]i, ΔΨm, ROS, QDF y caspasa. -Se determinaron actividades del 8/3/9. El resultado muestra que la concentración de [Ca2+]i comenzó a aumentar significativamente a la 1 h, y luego las actividades ROS, QDF y caspasa-3/9 comenzaron a aumentar significativamente y el ΔΨm comenzó a disminuir significativamente a las 2 h; la PADR más alta se obtuvo a las 4 h. Los resultados se expresan como media ± DE, n = 5. *Diferencia significativa con respecto a la muestra de control (0,0 μg/ml), P < 0,05. **Diferencia altamente significativa con respecto a la muestra de control (0,0 μg/ml), P < 0,01

Entre los 61 genes relacionados con la apoptosis investigados, 14 estaban significativamente regulados positivamente (como se muestra en la Fig. 5). Las curvas de fusión cuantitativa de fluorescencia de los 14 genes se muestran en el archivo adicional 2: Fig. S1. Entre los 14 genes regulados positivamente, itpr2, capn1, mc, actg1, actb, parp2, traf2 y fos se enriquecieron en la vía relacionada con la apoptosis inducida por la alteración de la homeostasis del [Ca2+] en el RE. Entre los ocho genes, fos aumentó significativamente a las 4 h, mientras que los otros genes aumentaron significativamente dentro de las 2 h. El gen gzmb, enriquecido en la vía de la granzima B, se reguló significativamente a las 16 h, y el gen tuba1c, enriquecido aguas abajo de la vía de la granzima B, se reguló significativamente a las 2 h. Los genes hras y raf1, enriquecidos en la vía de señalización MAPK, se incrementaron significativamente a las 2 h, y el gen hras también se incrementó significativamente a las 4 h. El gen akt1, enriquecido en la vía de señalización PI3K-Akt, se reguló significativamente a las 2 h. El gen atm, el regulador ascendente de la vía de señalización de p53, se reguló significativamente a las 2, 4 y 16 h.

Expresión de ARNm de genes relacionados con la apoptosis en tomonts Cryptocaryon irritans tratados con honokiol. La expresión de ARNm de los genes relacionados con la apoptosis en tomonts de C. irritans se trató respectivamente con 1,0 μg/ml de honokiol a las 0, 1, 2, 4, 8 y 16 h. Los resultados muestran que un total de 14 genes aumentaron significativamente en diferentes momentos. Los resultados se expresan como media ± DE, n = 3. *Diferencia significativa con respecto al control (0,0 μg/ml), P < 0,05. **Diferencia altamente significativa con respecto al control (0,0 μg/ml), P < 0,01

La vía de muerte similar a la apoptosis se ha encontrado en muchos protozoos, como Leishmania, P. falciparum, T. thermophila, T. cruzi, B. hominis, T. gondii e I. multifiliis [12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21]. Ichthyophthirius multifiliis es el patógeno de la enfermedad de la mancha blanca de agua dulce, cuya morfología y ciclo de vida son similares a los de C. irritans [1]. Se ha informado que los anticuerpos de la piel de pescado podrían causar fenómenos similares a la apoptosis de I. multifiliis, como la externalización de PS y la condensación de cromatina [16]. También se ha informado que el verde de malaquita podría causar fenómenos similares a la apoptosis de I. multifiliis, como hinchazón mitocondrial, destrucción de la integridad de la membrana mitocondrial, cambio en el número de ribosomas y externalización de PS a través de la vía de señal PI3K-Akt [21]. En este estudio, se demostró que el honokiol causa atrofia significativa del citoplasma de C. irritans tomont, reducción del volumen celular, externalización de PS, un aumento significativo en QDF, concentración de [Ca2+]i, actividades de ROS y caspasa-3/9, una disminución significativa en ΔΨm y una regulación positiva significativa de la expresión del ARNm de los 14 genes relacionados con la apoptosis; esto sugiere fuertemente que C. irritans tomonts tiene una forma de muerte regulada similar a la apoptosis. La muerte similar a la apoptosis denominada por el Comité de Nomenclatura sobre Muerte Celular (NCCD) se asemeja a la apoptosis de los metazoos [35] y ha sido considerada una estrategia ideal para prevenir y tratar enfermedades parasitarias [11, 36]. Aunque este estudio ha demostrado que existe una muerte similar a la apoptosis en C. irritans tomonts, lo que proporciona una nueva forma potencial de tratar la enfermedad de la mancha blanca de los peces marinos con las ventajas de una menor probabilidad de resistencia a los medicamentos y efectos adversos, se necesitan más estudios para descubrir y confirmar el mecanismo por el que el honokiol induce una muerte similar a la apoptosis de C. irritans tomont.

Se ha informado que el honokiol, como uno de los principales componentes activos de M. officinalis, induce la apoptosis de varias células, como las células de neuroblastoma, las células A549, las células 95-D y las células de condrosarcoma humano, hongos como C. albicans y parásitos protozoarios como Leishmania a través de la vía de estrés del RE [8, 27,28,29,30, 36,37,38,39]. La vía de estrés del RE informada que induce la apoptosis celular se resume en la Fig. 6, que muestra que fármacos como el honokiol y factores fisiológicos o ambientales pueden causar un estrés del RE excesivo o aberrante [30, 40,41,42]. El estrés excesivo o aberrante del RE conduce a la liberación de Ca2+ del RE a través del receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) y a la acumulación de respuesta de proteína desplegada (UPR) [43,44,45,46,47]. Cho et al. [48] ​​informaron que el honokiol podría promover la liberación de [Ca2+]i y aumentar la concentración de [Ca2+]i al inhibir la actividad de la proteína 44 del retículo endoplásmico (ERP44), que tiene actividad inhibidora sobre los IP3R del canal de calcio [49]. De manera similar, la concentración de [Ca2+]i aumentó significativamente por primera vez en los tomonts de C. irritans en este estudio. El aumento de Ca2+ puede provocar dos reacciones importantes, Reacción I y Reacción II. En la Reacción I, el aumento de Ca2+ puede provocar la reacción en cascada de las caspasas, incluidas las calpaínas, la caspasa-12 y la caspasa-3 [50,51,52]. Coincidiendo con la Reacción I, la expresión del ARNm del gen capn1 que codifica la calpaína se reguló significativamente y la actividad de la caspasa-3 aumentó significativamente en los tomonts de C. irritans. Mediante la explosión en el genoma de C. irritans, no se encontró el gen caspasa-12 que codifica la caspasa-12, pero se encontró el gen mc que codifica la metacaspasa, y su expresión de ARNm también se incrementó significativamente. Se ha informado que la metacaspasa tiene una función de regulación de la apoptosis en protozoos como Leishmania y Plasmodium, que es similar a la caspasa-12 en los metazoos [11, 53, 54]. En la Reacción II, el aumento de [Ca2+]i también puede disminuir el ΔΨm de las mitocondrias y luego promover la producción y liberación de ROS de las mitocondrias [44, 55, 56]. Un aumento en ROS puede promover aún más la liberación de [Ca2+]I y aumentar el QDF, y luego las mitocondrias activan secuencialmente la caspasa-9 y la caspasa-3 a través del factor 1 activador de proteasa apoptótica (Apaf1) combinado con el citocromo c (CytC) [45, 57 ]. De acuerdo con la Reacción II, se ha demostrado que honokiol disminuye significativamente el ΔΨm de las mitocondrias y aumenta la producción de ROS, las actividades de caspasa-9 y caspasa-3 y QDF en tomonts de C. irritans. La caspasa-3 activada puede hidrolizar y desactivar actinas y poli ADP-ribosa polimerasa (PARP) [58,59,60]. Las actinas intervienen en el mantenimiento del citoesqueleto. Por lo tanto, las actinas hidrolizadas causan atrofia del citoplasma y reducción del volumen celular [61,62,63], mientras que las PARP hidrolizadas causan daño irreversible al ADN y aumento del QDF [64,65,66]. Para respaldar estos fenómenos, este artículo ha demostrado que el honokiol podría aumentar significativamente las expresiones de ARNm de los genes actg1, actb y parp2, que codifican respectivamente actinas y PARP, causan atrofia del citoplasma de C. irritans tomont y reducción del volumen celular, y aumentan el QDF. 67,68,69]. Además de esta vía de apoptosis, causada por el estrés del ER a través de Ca2+, el estrés del ER también conduce a la acumulación de UPR. En condiciones homeostáticas, las proteínas implicadas en la UPR, la proteína quinasa quinasa del retículo endoplásmico similar al ARN (PERK), el factor de transcripción activador 6 (ATF6) y la enzima 1α que requiere inositol (IRE1α) están unidas a la proteína regulada por glucosa 78 (GRP78). por sus dominios de luz del RE, manteniéndolos inactivos. Con la acumulación de UPR, lo que hace que GRP78 abandone PERK, ATF6 e IRE1α, se induce la activación de estas proteínas [45,46,47] (Fig. 6). El PERK activado activa la reacción en cascada, incluida la subunidad alfa del factor 2 de iniciación de la traducción eucariótica (eiF2α), la activación del factor de transcripción 4 (ATF4) y la transcripción 3 inducible por daño del ADN (DDIT3). DDIT3 puede disminuir la expresión de proteínas antiapoptosis, como el linfoma de células B 2 (Bcl-2), y aumentar la expresión de proteínas proapoptosis, como el mediador de la muerte celular que interactúa con Bcl-2 (Bim). Luego, las mitocondrias activan secuencialmente caspasa-9 y caspasa-3 a través de Apaf1 combinado con CytC. Finalmente, se induce la apoptosis celular [46]. El ATF6 activado también activa DDIT3 e induce la apoptosis a través de la vía de las mitocondrias. El IRE1α activado, combinado con el factor 2 asociado al receptor de TNF (TRAF2), activa reacciones en cascada, incluida la quinasa 1 reguladora de la señal de apoptosis (ASK1) y la quinasa n-terminal c-jun (JNK). Las JNK son responsables de la fosforilación de las proteínas mitocondriales Bim (proapoptosis) y Bcl2 (antiapoptosis), que se activan e inhiben, respectivamente. Luego, las JNK activadas inducen la vía de apoptosis de las mitocondrias o regulan positivamente la expresión del protooncogén jun (c-jun) y del protooncogén fos (API), aumentan el QDF e inducen la apoptosis celular [45,46,47]. Aunque las expresiones de ARNm de traf2 y fos en esta vía fueron significativamente reguladas positivamente por honokiol, las de eif2ak3, eif2s1, ern1, map3k5, mapk9 y mapk10 mostraron cambios no significativos cuando los tomonts de C. irritans fueron tratados con honokiol. Esto sugiere que el honokiol podría no inducir la apoptosis de C. irritans tomont a través de esta vía. En resumen, los resultados de este estudio sugieren que el honokiol podría inhibir la actividad de ERP44 y la liberación ilimitada de [Ca2+]i de IP3R, alterar la homeostasis de [Ca2+]i en el RE y luego inducir una muerte similar a la apoptosis de C. irritans tomont mediante cascada de caspasas o vía mitocondrial. Sin embargo, se necesitan más estudios, como los análisis transcriptómicos o proteómicos, para confirmar esta sugerencia.

Mecanismo regulador de la apoptosis inducida por el estrés del RE. Esta figura muestra que la vía clásica de estrés del RE induce la apoptosis celular. Apaf1, Cytc, Fodrin, PERK, eiF2α, IRE1α, TRAF2, ASK1 y API se codificaron con apaf1, cycs, sptan1, eif2ak3, eif2s1, ern1, traf2, map3k5 y fos, respectivamente. La actina beta y la actina γ se codificaron respectivamente con actb y actg1. Las calpaínas incluían la subunidad catalítica calpaína-1 y la subunidad catalítica calpaína-2, que estaban codificadas con capn1 y capn2. Las PARP incluyen la poli [ADP-ribosa] polimerasa 2 y la poli [ADP-ribosa] polimerasa 4, que estaban codificadas con parp2 y parp4. Las JNK incluyen la proteína quinasa 9 activada por mitógenos y la proteína quinasa 10 activada por mitógenos, que se codificaron respectivamente con mapk9 y mapk10. Los IP3R incluyen el receptor de inositol 1,4,5-trifosfato tipo 2 y el receptor de inositol 1,4,5-trifosfato tipo 3, que se codificaron respectivamente con itpr1, itpr2 e itpr3. La expresión de ARNm de itpr2, capn1, mc, actg1, actb, parp2, traf2 y fos aumentó significativamente en este estudio.

Este artículo demostró que el honokiol puede inducir una muerte similar a la apoptosis de C. irritans tomont y sugirió que el honokiol puede alterar la homeostasis del [Ca2+]i en el RE y luego inducir una muerte similar a la apoptosis de C. irritans tomont mediante la cascada de caspasas y la vía mitocondrial. Esto podría representar una nueva intervención terapéutica para la infección por C. irritans. A continuación, continuaremos con la investigación sobre anti-C seguros y eficientes. irritans, es necesario verificar el objetivo intracelular del honokiol en C. irritans.

Los datos que respaldan las conclusiones de este artículo se incluyen dentro del artículo.

Irritantes criptocarión

Retículo endoplásmico

Precio normal

Tasa de mortalidad similar a la apoptosis en profase

Tasa de mortalidad similar a la apoptosis en anafase

Tasa de necrosis

Concentración de calcio intracelular

Potencial de membrana mitocondrial

Especies de oxígeno reactivas

Cantidad de fragmentaciones de ADN.

Receptor de inositol 1,4,5-trifosfato

Respuesta de proteína desplegada

Proteína del retículo endoplásmico 44

Factor 1 activador de proteasa apoptótica

Citocromo c

Poli ADP-ribosa polimerasa

Proteína quinasa quinasa del retículo endoplásmico similar al ARN

Activación del factor de transcripción 6

Enzima 1α que requiere inositol

Proteína regulada por glucosa 78

Subunidad alfa del factor 2 de iniciación de la traducción eucariótica

Activación del factor de transcripción 4

Transcripción inducible por daño al ADN 3

Linfoma de células B 2

Mediador interactivo de la muerte celular con Bcl-2.

Factor 2 asociado al receptor de TNF

Quinasa 1 reguladora de señales de apoptosis

Quinasa C-jun n-terminal

Protooncogén Jun

Protooncogén fos

Marrón EM. Un nuevo protozoo parásito, el organismo causal de la enfermedad de la mancha blanca en peces marinos Cryptocaryon irritans Gen at sp.n. Resumen del orden del día. Sci conoce a Zool Soc Lond. 1951;11:1–2.

Google Académico

Sun HY, Zhu XQ, Xie MQ, Wu XY, Li AX, Lin RQ, et al. Caracterización de aislados de Cryptocaryon irritans de peces marinos en China continental mediante sus secuencias de ADN ribosómico. Res. Parasitol. 2006;99:160–6.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Imajoh M, Morimitu K, Sukeda M, Umezaki T, Monno S, Goda H, et al. Detección por PCR en tiempo real TaqMan y análisis filogenético de irritantes Cryptocaryon en Nomi Bay, Kochi. Pathol de pescado japonés. 2016;51:103–11.

Artículo de Google Scholar

Van KV, Nhinh DT. La prevalencia de Cryptocaryon irritans en peces ornamentales marinos silvestres de Vietnam. Serie IOP Conf: Ciencia del medio ambiente terrestre. 2018;137:1755–1307.

Google Académico

Dan XM, Li AX, Lin XT, Teng N, Zhu XQ. Un método estandarizado para propagar Cryptocaryon irritans en un pámpano huésped susceptible Trachinotus ovatus. Acuicultura. 2006;258:127–33.

Artículo de Google Scholar

Galluzzi L, Vitale I, Aaronson SA, Abrams JM, Adam D, Agostinis P, et al. Mecanismos moleculares de muerte celular: recomendaciones del comité de nomenclatura sobre muerte celular 2018. Cell Death Differ. 2018;25:486–541.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Goldar S, Khaniani MS, Derakhshan SM, Baradaran B. Mecanismos moleculares de la apoptosis y funciones en el desarrollo y tratamiento del cáncer. Cáncer J de Asia Pacífico Anterior. 2015;16:2129–44.

Artículo de Google Scholar

Kim C, Kim B. Productos naturales anticancerígenos y sus compuestos bioactivos que inducen la apoptosis mediada por estrés del RE: una revisión. Nutrientes. 2018;10:1021.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Sugiura R, Satoh R, Takasaki T. ERK: un arma de doble filo en el cáncer La apoptosis dependiente de ERK como posible estrategia terapéutica para el cáncer. Células. 2021;10:2509.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fulda S. Apuntar a la apoptosis extrínseca en el cáncer: desafíos y oportunidades. Semin Cell Dev Biol. 2015;39:20–5.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Basmaciyan L, Casanova M. Muerte celular en Leishmania. Parásito. 2019;26:71.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Gannavaram S, Debrabant A. Muerte celular programada en Leishmania: evidencia bioquímica y papel en la infectividad del parásito. Microbiol de infección de células frontales. 2012;2:95.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Reece SE, Pollitt LC, Colegrave N, Gardner A. El significado de la muerte: evolución y ecología de la apoptosis en parásitos protozoarios. Patógeno PLoS. 2011;7:e1002320.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ch'ng JH, Kotturi SR, Chong AG, Lear MJ, Tan KS. Una vía de muerte celular programada en el parásito de la malaria Plasmodium falciparum tiene características generales de la apoptosis de los mamíferos, pero está mediada por cisteína proteasas del clan CA. Enfermedad por muerte celular. 2010;1:e26.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Tan KS, Howe J, Yap EH, Singh M. ¿Las formas de colonias de Blastocystis hominis sufren muerte celular programada? Res. Parasitol. 2001;87:362–7.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Xu DH, Klesius PH, Shoemaker CA. Los anticuerpos cutáneos del bagre de canal, Ictalurus punctatus (Rafinesque), inmunes a Ichthyophthirius multifiliis (Ich) pueden inducir la apoptosis de Ich Theronts. J Pescado Dis. 2005;28:213–20.

Artículo PubMed Google Scholar

Bruchhaus I, Roeder T, Rennenberg A, Heussler VT. Parásitos protozoarios: muerte celular programada como mecanismo de parasitismo. Tendencias Parasitol. 2007;23:376–83.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ni Nyoman AD, Lüder CG. Vías de muerte celular similares a la apoptosis en el parásito unicelular Toxoplasma gondii después del tratamiento con inductores de apoptosis y agentes quimioterapéuticos: un estudio de prueba de concepto. Programa Apopt Int J Muerte celular. 2013;18:664–80.

Artículo de Google Scholar

Ye Q, Zhang C, Wang Z, Feng Y, Zhou A, Xie S, et al. Inducción de estrés oxidativo, apoptosis y daño al ADN por Koumine en Tetrahymena thermophila. Más uno. 2019;14:e0212231.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bethencourt-Estrella CJ, Delgado-Hernández S, López-Arencibia A, San Nicolás-Hernández D, Sifaoui I, Tejedor D, et al. Acrylonitrile derivatives against Trypanosoma cruzi: in vitro activity and programmed cell death study. Pharmaceuticals. 2021;14:552.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qu S, Song C, Tan X, Wang G, Ling F. El análisis proteómico comparativo proporciona información sobre las proteínas clave como objetivos potenciales subyacentes al efecto del verde de malaquita contra Ichthyophthirius multifiliis. J Pescado Dis. 2021;44:881–92.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lokanathan Y, Mohd-Adnan A, Wan KL, Nathan S. El análisis del transcriptoma de la etapa tomont de Cryptocaryon irritans identifica genes potenciales para la detección y el control de la criptocarionosis. Genómica BMC. 2010;11:76.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Mo ZQ, Li YW, Wang HQ, Wang JL, Ni LY, Yang M, et al. Perfil transcripcional comparativo del parásito del pez Cryptocaryon irritans. Vectores parásitos. 2016;9:630.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Yin F, Sun P, Wang J, Gao Q. Análisis del transcriptoma de tomonts inactivos del ciliado ectoparásito de peces marinos Cryptocaryon irritans a baja temperatura. Vectores parásitos. 2016;9:280.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen R, Mao Y, Wang J, Liu M, Qiao Y, Zheng L, et al. Mecanismos moleculares de un péptido antimicrobiano piscidina (Lc-pis) en un protozoo parásito. Cryptocaryon Irritans BMC Geno. 2018;19:192.

Artículo de Google Scholar

Chi H, Goldstein M, Pichardo A, Wei ZH, Chang WJ, Gong H. Infectividad y genes expresados ​​diferencialmente entre células jóvenes y envejecidas del parásito de peces marinos Cryptocaryon irritans. Más uno. 2020;15:e0238167.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Deng J, Qian Y, Geng L, Chen J, Wang X, Xie H, et al. Participación de la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos p38 en la apoptosis inducida por honokiol en una línea celular de hepatoma humano (hepG2). Hígado Int. 2008;28:1458–64.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sun L, Liao K, Hang C, Wang D. Honokiol induce la apoptosis mediada por especies reactivas de oxígeno en Candida albicans a través de la disfunción mitocondrial. Más uno. 2017;12:e0172228.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Rauf A, Olatunde A, Imran M, Alhumaydhi FA, Aljohani ASM, Khan SA, et al. Honokiol: una revisión de su potencial farmacológico y conocimientos terapéuticos. Phytomed Int J Phytother Phytopharmacol. 2021;90:153647.

CAS Google Académico

Zhu J, Xu S, Gao W, Feng J, Zhao G. Honokiol induce la apoptosis mediada por estrés del retículo endoplásmico en células de cáncer de pulmón humano. Ciencias de la vida. 2019;221:204–11.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhong ZH, Guo WL, Lei Y, Wang F, Wang SF, Sun Y, et al. Eficacia antiparasitaria del honokiol contra Cryptocaryon irritans en Pompano, Trachinotus ovatus. Acuicultura. 2019;500:398–406.

Artículo CAS Google Scholar

Zhang L, Dong L, Yang L, Luo Y, Chen F. MiR-27a-5p regula la disfunción mitocondrial inducida por acrilamida y la apoptosis intrínseca dirigiéndose a Btf3 en ratas. Química de los alimentos. 2022;368:130816.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Li Z, Li X, Liu T, Chen S, Liu H, Wang H, et al. Las funciones críticas de los residuos de la superficie expuesta para la termoestabilidad y la halotolerancia de una nueva xilanasa GH11 de la biblioteca metagenómica de un suelo salino-alcalino. Int J Biol Macromol. 2019;133:316–23.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bai Y, Zhou Z, Zhao J, Ke Q, Pu F, Wu L, et al. El borrador del genoma de Cryptocaryon irritans proporciona información preliminar sobre la filogenia de los ciliados. Genet delantero. 2022;12:808366.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kroemer G, Galluzzi L, Vandenabeele P, Abrams J, Alnemri ES, Baehrecke EH, et al. Clasificación de la Muerte Celular: recomendaciones del comité de nomenclatura sobre muerte celular 2009. Cell Death Differ. 2009;16:3–11.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dolai S, Adak S. Respuestas al estrés del retículo endoplásmico en Leishmania. Parasitol de Mol Biochem. 2014;197:1–8.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sí PS, Wang W, Chang YA, Lin CJ, Wang JJ, Chen RM. Honokiol induce la autofagia de las células de neuroblastoma mediante la activación de las vías de señalización PI3K/Akt/mTOR y estrés reticular endoplásmico/ERK1/2 y suprimiendo la migración celular. Cáncer Lett. 2016;370:66–77.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chen YJ, Wu CL, Liu JF, Fong YC, Hsu SF, Li TM, et al. Honokiol induce la apoptosis celular en células de condrosarcoma humano a través de disfunción mitocondrial y estrés del retículo endoplásmico. Cáncer Lett. 2010;291:20–30.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dolai S, Pal S, Yadav RK, Adak S. Apoptosis inducida por estrés del retículo endoplásmico en Leishmania a través de un mecanismo dependiente de Ca2+ e independiente de caspasa. J Biol Chem. 2011;286:13638–46.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Oakes SA, Papa FR. El papel del estrés del retículo endoplásmico en la patología humana. Annu Rev. Pathol. 2015;10:173–94.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chiu CS, Tsai CH, Hsieh MS, Tsai SC, Jan YJ, Lin WY, et al. La explotación de la activación CHOP de estrés ER inducida por honokiol inhibe el crecimiento y la metástasis del melanoma al suprimir las vías mitf y β-catenina. Cáncer Lett. 2019;442:113–25.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Liu SH, Lee WJ, Lai DW, Wu SM, Liu CY, Tien HR, et al. Honokiol Confiere inmunogenicidad al dictar la exposición a la calreticulina, activando el estrés del ER e inhibiendo la transición epitelial a mesenquimatosa. Mol Oncol. 2015;9:834–49.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Breckenridge DG, Germain M, Mathai JP, Nguyen M, Shore GC. Regulación de la apoptosis por vías del retículo endoplásmico. Oncogén. 2003;22:8608–18.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Marchi S, Patergnani S, Missiroli S, Morciano G, Rimessi A, Wieckowski MR, et al. Homeostasis del calcio del retículo endoplásmico y mitocondrial y muerte celular. Calcio celular. 2018;69:62–72.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Burton GJ, Yung HW, Murray AJ. Interacciones mitocondriales-retículo endoplásmico en el trofoblasto: estrés y senescencia. Placenta. 2017;52:146–55.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bastida-Ruiz D, Aguilar E, Ditisheim A, Yart L, Cohen M. Respuestas al estrés del retículo endoplásmico en la placentación: un verdadero acto de equilibrio. Placenta. 2017;57:163–9.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Liu KS, Peng ZH, Cheng WJ, Dai CF, Tong H. Apoptosis inducida por estrés del retículo endoplásmico en el desarrollo de la reproducción. Anticoncepción reproductiva. 2016;27:51–9.

CAS Google Académico

Cho JH, Jeon YJ, Park SM, Shin JC, Lee TH, Jung S, et al. Efectos multifuncionales del honokiol como fármaco antiinflamatorio y anticancerígeno en xenoinjertos y células cancerosas escamosas orales humanas. Biomateriales. 2015;53:274–84.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Higo T, Hattori M, Nakamura T, Natsume T, Michikawa T, Mikoshiba K. Regulación específica del subtipo y dependiente del entorno lumenal del RE del receptor de inositol 1,4,5-trifosfato tipo 1 por ERp44. Celúla. 2005;120:85–98.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hara T, Mahadevan J, Kanekura K, Hara M, Lu S, Urano F. La salida de calcio del retículo endoplásmico conduce a la muerte de las células β. Endocrinología. 2014;155:758–68.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kopil CM, Siebert AP, Foskett JK, Neumar RW. El receptor de inositol 1,4,5-trifosfato tipo 1 escindido por calpaína altera la amortiguación del Ca2+ del RE y causa neurodegeneración en las neuronas corticales primarias. J Neuroquímica. 2012;123:147–58.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fan TJ, Han LH, Cong RS, Liang J. Proteasas de la familia Caspasa y apoptosis. Acta Biochim Biophys Sin. 2005;37:719–27.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dixit R, Tiwari R, Katyal A, Pandey KC. Metacaspasas: posible objetivo farmacológico contra parásitos protozoarios. Frente Farmacéutico. 2019;10:790.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Eh SU. Diversidad evolutiva y función de las metacaspasas en plantas: similares pero no a las caspasas. Int J Mol Ciencia. 2022;23:4588.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

diputado Murphy. Cómo las mitocondrias producen especies reactivas de oxígeno. Biochem J. 2009;417:1–13.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Görlach A, Klappa P, Kietzmann T. El retículo endoplásmico: plegamiento, homeostasis del calcio, señalización y control redox. Señal redox antioxidante. 2006;8:1391–418.

Artículo PubMed Google Scholar

Estaquier J, Vallette F, Vayssiere JL, Mignotte B. Las vías mitocondriales de la apoptosis. Exp. avanzada con biol. 2012;942:157–83.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mashima T, Naito M, Tsuruo T. La escisión de actina citoesquelética mediada por caspasa juega un papel positivo en el proceso de apoptosis morfológica. Oncogén. 1999;18:2423–30.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ame JC, Spenlehauer C, de Murcia G. La superfamilia PARP. Bioensayos. 2004;26:882–93.

Artículo PubMed Google Scholar

Gourlay CW, Ayscough KR. El citoesqueleto de actina en el envejecimiento y la apoptosis. FEMS Levadura Res. 2005;5:1193–8.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhu M, Yang T, Wei S, DeWan AT, Morell RJ, Elfenbein JL, et al. Las mutaciones en el gen de la gamma actina (ACTG1) se asocian con sordera progresiva dominante (DFNA20/26). Soy J Hum Genet. 2003;73:1082–91.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Erba HP, Eddy R, Shows T, Kedes L, Gunning P. Estructura, ubicación cromosómica y expresión del gen de actina gamma humana: evolución diferencial, ubicación y expresión de los genes de actina gamma y beta citoesqueléticos. Biol celular mol. 1988;8:1775–89.

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Drazic A, Aksnes H, Marie M, Boczkowska M, Varland S, Timmerman E, et al. NAA80 es la acetiltransferasa N-terminal de actina y regula el ensamblaje del citoesqueleto y la motilidad celular. Proc Natl Acad Sci Estados Unidos. 2018;115:4399–404.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen Q, Kassab MA, Dantzer F, Yu X. PARP2 media la poli-ADP-ribosilación ramificada en respuesta al daño del ADN. Comuna Nacional. 2018;9:3233.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Bilokapic S, Suskiewicz MJ, Ahel I, Halic M. La unión de roturas del ADN activa PARP2-HPF1 para modificar la cromatina. Naturaleza. 2020;585:609–13.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Obaji E, Maksimainen MM, Galera-Prat A, Lehtiö L. La activación de PARP2/ARTD2 por daño en el ADN induce cambios conformacionales que alivian la autoinhibición enzimática. Comuna Nacional. 2021;12:3479.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Elmore S. Apoptosis: una revisión de la muerte celular programada. Toxicol Pathol. 2007;35:495–516.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Majtnerová P, Roušar T. Una descripción general de los ensayos de apoptosis que detectan la fragmentación del ADN. Representante de Mol Biol. 2018;45:1469–78.

Artículo PubMed Google Scholar

D'Arcy MS. Muerte celular: una revisión de las principales formas de necrosis por apoptosis y autofagia. Cell Biol Int. 2019;43:582–92.

Artículo PubMed Google Scholar

Untergasser A, Cutcutache I, Koressaar T, Ye J, Faircloth BC, Remm M, et al. Primer3: nuevas capacidades e interfaces. Ácidos nucleicos res. 2012;40:e1

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (no. 31960739), el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2021YFC2600600), el Fondo Especial de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Hainan (ZDKJ2021016) y la Fundación Especial de Agricultura y Agricultura. Oficina del condado de Lingao, Hainan, China (n.º ZLHX2018-124R).

Laboratorio Provincial Clave de Hidrobiología y Biotecnología Tropical de Hainan, Facultad de Ciencias Marinas, Universidad de Hainan, Haikou, 570228, República Popular de China

Zi-Chen Zhao, Man-Yi Jiang, Ji-Hui Huang, Wei-Liang Guo, Zhi-Hong Zhong, Qing-Qin Huang, Shao-Long Liu, Heng-Wei Deng y Yong-Can Zhou

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Hainan, Haikou, 570228, República Popular China

Zi-Chen Zhao

Departamento de Acuicultura, Escuela de Agricultura de Hainan, Haikou, 571101, República Popular China

Chuan Lin

Centro Tecnológico del Distrito Aduanero de Haikou, Haikou, 570105, República Popular China

Ji-Hui Huang

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WLG y ZCZ finalizaron la concepción y el diseño de este estudio. ZCZ, MYJ, SLL y QQH finalizaron los experimentos de este estudio. YCZ, WLG y ZCZ finalizaron la redacción, edición y revisión de este artículo. JHH, HWD, CL y ZHZ finalizaron la discusión y los comentarios de este artículo. YCZ y WLG estuvieron a cargo en general de esta investigación.

Correspondencia a Wei-Liang Guo o Yong-Can Zhou.

El experimento cumplió con la octava edición de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Comité para la Actualización de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, 2011). Fue autorizado por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Hainan (HNUAUCC-2020-00002).

Todos los autores dan su consentimiento para la publicación.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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Tabla S1. Los 61 genes relacionados con la apoptosis y sus cebadores utilizados en este estudio.

Figura S1. Las curvas de fusión cuantitativa de fluorescencia de los 14 genes expresados ​​de manera significativamente diferencial.

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Reimpresiones y permisos

Zhao, ZC., Jiang, MY., Huang, JH. et al. Honokiol induce una muerte similar a la apoptosis en Cryptocaryon irritans Tomont. Vectores de parásitos 16, 287 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05910-1

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Recibido: 26 de mayo de 2023

Aceptado: 31 de julio de 2023

Publicado: 16 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05910-1

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