Generación de un virus Saffold recombinante que expresa UnaG como marcador para la visualización de infección viral

Revista de Virología volumen 20, Número de artículo: 175 (2023) Citar este artículo

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El virus Saffold (SAFV), que pertenece al género Cardiovirus de la familia Picornaviridae, se asocia con enfermedades respiratorias o gastrointestinales agudas en niños; También se sospecha que causa enfermedades graves, como parálisis fláccida aguda y meningitis aséptica. Sin embargo, la comprensión del mecanismo de su patogenicidad aún es limitada debido a las muchas incógnitas sobre su ciclo de vida; por ejemplo, queda por determinar el receptor celular para su infección. Se requiere un sistema para monitorear la infección por SAFV in vitro e in vivo para acelerar la investigación sobre SAFV.

Generamos un SAFV recombinante que expresa la proteína fluorescente verde (GFP) o UnaG, una nueva proteína fluorescente derivada de la anguila japonesa. Las células HeLa infectadas por SAFV que expresa GFP o UnaG mostraron una señal fluorescente de color verde brillante, lo que permitió un seguimiento conveniente de la infección por SAFV. Sin embargo, la expresión de GFP pero no de UnaG se perdió rápidamente durante el paso del virus debido a la diferencia en la estabilidad genética en el genoma del virus SAFV; el gen UnaG se mantuvo estable en el genoma del virus después de al menos cinco pases.

La infección por SAFV de células cultivadas se puede controlar fácilmente utilizando SAFV que expresa UnaG, que es superior a GFP en términos de estabilidad genética en el genoma del virus. Este virus podría ser una herramienta útil para la investigación del SAFV, como comparar la susceptibilidad de varias células a la infección por SAFV y evaluar los efectos de los antivirales sobre la infección por SAFV en exámenes de detección de alto rendimiento.

El virus Saffold (SAFV) pertenece al género Cardiovirus de la familia Picornaviridae, que es una partícula pequeña, sin envoltura, icosaédrica y con un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo. SAFV fue descubierto como el primer cardiovirus humano en 2007 en las heces de un bebé que presentó fiebre de origen desconocido en 1981 [1]. Desde entonces, se ha informado de la detección de SAFV en niños que padecen enfermedades respiratorias o gastrointestinales agudas [2,3,4,5,6]. Además, se han detectado SAFV en muestras de pacientes con enfermedades graves (p. ej., parálisis flácida aguda, meningitis aséptica, miocarditis, pancreatitis aguda y cerebelitis) [7,8,9,10,11]. Sin embargo, la patogenicidad del SAFV, que causa una variedad de síntomas de leves a graves, aún no está clara. El uso de un SAFV recombinante que albergue un gen indicador, como la proteína verde fluorescente (GFP), que permite un seguimiento conveniente y en tiempo real de la replicación del SAFV in vitro e in vivo, sería muy beneficioso para dilucidar el mecanismo de patogenicidad del SAFV.

El genoma de SAFV consta de un marco de lectura abierto largo (ORF), regiones no traducidas (UTR) 5' y 3' y una cola poli (A) de longitud variable en la UTR 3'. El ORF codifica una proteína líder (L), cuatro proteínas de la cápside (VP1 a VP4) y siete proteínas no estructurales (2 A, 2B, 2 C, 3 A, 3B, 3 C y 3D) [1]. La poliproteína se traduce desde el ORF y luego la proteasa 3 C la procesa en proteínas virales maduras postraduccionalmente, mientras que la separación cotraduccional de la poliproteína se produce en el motivo StopGo. Este motivo es el oligopéptido D(V/I) ExNPG|P (donde “|” representa la unión entre 2 A y 2B) que media el proceso StopGo [12, 13], y se conserva en la unión 2 A/2B de SAFV. (DIETNPG|P) [14]. El proceso StopGo también se conoce como "salto ribosómico" o "Stop-Carry On" y previene la formación de un enlace peptídico entre la glicina y la prolina, pero permite la continuación de la traducción.

Para avanzar en los estudios patogénicos moleculares de SAFV utilizando genética inversa, previamente establecimos un clon de ADNc infeccioso de SAFV-3 (la cepa JPN08-404) [8]. En el presente estudio, basado en este clon de ADNc, generamos dos SAFV recombinantes que expresan un gen indicador, GFP o UnaG, para detectar fácilmente la infección en células vivas insertándolas entre 2 A y 2B usando el motivo StopGo. UnaG es una nueva proteína verde fluorescente derivada de la anguila japonesa [15], que, con 139 aminoácidos, es más pequeña en comparación con la GFP (239 aminoácidos). En el presente estudio, demostramos que UnaG es un marcador superior de infección por SAFV a GFP con respecto a la estabilidad genómica del genoma del virus. Además, mostramos la utilidad del SAFV que expresa UnaG para el estudio de la infección por SAFV y la detección de medicamentos antivirales.

Para generar un genotipo 3 recombinante de SAFV (SAFV-3) que expresa un indicador, insertamos un gen GFP o UnaG, con dos motivos StopGo en los extremos 5' y 3', en el ADNc de longitud completa de SAFV-3 (JPN08- 404 cepa) [8]. Esto debería permitir la traducción de proteínas fluorescentes sin pérdida de proteínas virales. Consideramos que la inserción de genes indicadores entre 2A y 2B utilizando el motivo StopGo era superior a otros métodos, como insertarlos en 3' UTR o 5' UTR, por las siguientes razones: En primer lugar, la secuencia precisa reconocida por el SAFV 3 Se desconocía la proteasa C, necesaria para separar las proteínas indicadoras de la poliproteína viral cuando se inserta en la UTR 3' o la UTR 5'. En segundo lugar, la inserción de genes informadores en 3'UTR podría conducir potencialmente a una producción reducida de proteínas informadoras, ya que la traducción de proteínas virales aguas abajo de 2B es baja en los cardiovirus [16, 17]. Designamos estos clones de ADNc de SAFV-3 recombinante que expresa GFP y UnaG como pSAF/GFP y pSAF/UnaG, respectivamente (Fig. 1A). Luego, el ARN infeccioso se transcribió in vitro a partir de pSAF/GFP y pSAF/UnaG linealizados con NotI, y se transfectó en células BHK-21 para generar el SAFV-3 recombinante que expresa GFP y UnaG (SAF/GFP y SAF/UnaG). . Las células transfectadas mostraron claramente una expresión comparable de GFP y UnaG y un efecto citopático (CPE) comparable (Fig. 1B y datos no mostrados). Para confirmar la producción de virus recombinantes infecciosos, inoculamos células HeLa con sobrenadantes de cultivos celulares de células BHK-21 transfectadas con ARN infeccioso que contenían virus de paso 0 (P0). Las células HeLa inoculadas mostraron la expresión de GFP y UnaG, junto con la aparición de CPE, confirmando así la producción de SAF/GFP y SAF/UnaG infecciosas (Fig. 1C). Al comparar la intensidad de fluorescencia de las células infectadas, las células infectadas con SAF/UnaG mostraron un valor de intensidad de fluorescencia media ligeramente inferior (48,32) en comparación con las células infectadas con SAF/GFP (57,82). Sin embargo, mostraron señales más consistentes que GFP, lo que se considera ventajoso al determinar la infección mediante microscopía de fluorescencia. Por lo tanto, estos resultados demostraron que tanto UnaG como GFP pueden usarse como proteína indicadora fluorescente para visualizar la infección por SAFV-3.

Generación de SAFV-3 que expresa reporteros. (A) Un diagrama esquemático de la inserción de la proteína fluorescente en el genoma SAFV y la generación del virus que expresa el indicador. Se insertó un gen de proteína fluorescente (UnaG o GFP) con motivos StopGo en los extremos 5' y 3' entre 2 A y 2B de pSAF404. Las construcciones resultantes (pSAF/UnaG y pSAF/GFP) se linealizaron con NotI y se sintetizó ARN a partir del promotor T7 mediante transcripción in vitro. Las puntas de flecha indican el sitio de separación mediante StopGo durante la traducción. Los péptidos subrayados representan motivos StopGo. Las secuencias peptídicas agregadas a ambos extremos de la proteína fluorescente se muestran en rojo. (B) Células BHK-21 transfectadas con transcritos de ARN sintetizados a partir de pSAF404, pSAF/GFP y pSAF/UnaG mediante la ARN polimerasa CUGA 7. A las 20 h después de la transfección, se recogieron células y sobrenadantes que contenían virus recombinantes. Las imágenes de las células transfectadas se fotografiaron utilizando un analizador de células fluorescentes inteligente JULI™ antes de la recolección. Barra de escala, 200 μm. (C) Las células HeLa infectadas con los virus P0 SAF/GFP o SAF/UnaG se fotografiaron 16 h después de la infección. Se representan los valores de intensidad media de fluorescencia y DE. Barra de escala, 100 μm. El gráfico representa la intensidad de fluorescencia de 50 células. Las barras horizontales rojas indican las medias. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba no paramétrica de Mann Whitney (*p = 0,0418)

Durante el proceso de paso para la propagación de reservas de virus SAF/GFP y SAF/UnaG, observamos una rápida pérdida de la expresión de GFP pero no de la expresión de UnaG en las células infectadas (datos no mostrados). Atribuimos la pérdida de la señal de GFP durante el pase a la pérdida del gen GFP en el genoma. Por lo tanto, investigamos la estabilidad genética de los genes GFP y UnaG en el genoma SAFV-3 mediante RT-PCR. Después de la recuperación inicial de los virus P0 SAF/GFP y SAF/UnaG, pasamos en serie estos virus cinco veces en células HeLa y preparamos reservas de virus P1, P3 y P5 SAF/UnaG y P3 SAF/GFP. La RT-PCR de estas poblaciones reveló que el gen GFP exógeno era inestable y se había desprendido del genoma SAFV-3; la GFP de longitud completa no se detectó en absoluto después de tres pases (Fig. 2A). Por el contrario, el gen UnaG se mantuvo estable y retenido dentro del genoma SAFV-3 durante al menos cinco pases (Fig. 2B). Estos resultados indicaron que el SAFV-3 recombinado sin GFP surgió y superó a SAF/GFP durante el paso, probablemente debido a la desventaja de crecimiento de SAF/GFP. Por otro lado, el tamaño relativamente más pequeño de UnaG podría contribuir a que se retenga de manera estable en el genoma SAFV-3 durante el pase. Esto es consistente con un informe anterior que muestra que el mengovirus, otro cardiovirus, puede albergar de manera estable genes exógenos de <500 a 600 bases, cuando se inserta entre 2A y 2B con motivos StopGo similares [18].

Estabilidad genética de los genomas SAF/GFP y SAF/UnaG. Para examinar la estabilidad genética de los genes GFP (A) y UnaG (B) en el genoma SAFV-3, se pasaron en serie virus SAF/GFP o SAF/UnaG en células Hela. Los ARN genómicos se extrajeron de los sobrenadantes clarificados de SAF/GFP (P3) y SAF/UnaG (P1, P3 y P5), seguido de RT-PCR. Los insertos de longitud completa se amplificaron utilizando pSAF/GFP y pSAF/UnaG como plantillas (carril C). Las posiciones de los marcadores de tamaño se indican a la izquierda de cada panel.

Para investigar si la inserción del gen exógeno UnaG en el genoma del virus afectaría la eficiencia de la replicación del virus, se analizó la cinética de crecimiento del virus SAF/UnaG mediante un ensayo de placa estándar utilizando células HeLa (Fig. 3). El título del virus SAF/UnaG alcanzó su máximo a las 24 h después de la infección, similar al virus SAFV-3 recombinante de tipo salvaje (SAF404). Además, la cinética de crecimiento del virus SAF/UnaG se parecía a los datos anteriores obtenidos de la cepa parental JPN08-404 y SAF404 derivado de ADNc [8]. Por lo tanto, estos resultados demostraron que la inserción de un gen indicador entre 2 A y 2B con motivos StopGo no perturba el ciclo de replicación e infección del SAFV-3 recombinante. En conjunto con la estabilidad del gen UnaG en el genoma de SAFV-3, estos resultados indicaron que el SAFV-3 recombinante que expresa UnaG podría ser una herramienta útil para la visualización de la infección por SAFV-3 en entornos experimentales.

Curva de crecimiento de SAF/UnaG en células HeLa. Las células HeLa se infectaron con SAFV-3 recombinante de tipo salvaje (SAF404) o SAF/UnaG a una MOI de 5. Los sobrenadantes del cultivo (círculo abierto) y las células (círculo cerrado) se recogieron en los tiempos indicados y se titularon mediante un ensayo de placa estándar. en células HeLa. Los títulos mostrados son la media ± desviación estándar en tres experimentos independientes.

Para verificar la utilidad de SAF/UnaG, primero infectamos células HeLa y BHK-21 con SAF/UnaG y comparamos el CPE y las señales fluorescentes en estas células. Nuestros estudios anteriores han informado que las células HeLa son altamente susceptibles a la infección por SAFV-3 [19, 20]. Cuando las células HeLa se infectaron con el virus SAF/UnaG, se observó que el CPE era similar al del virus de tipo salvaje y la señal de fluorescencia de UnaG en las células infectadas (Fig. 4A). Aunque las células BHK-21 transfectadas con el ARN infeccioso de SAFV-3 fueron capaces de producir progenie viral (Fig. 1B), las células BHK-21 inoculadas con el virus SAF/UnaG mostraron sólo células fluorescentes esporádicas y ningún aumento en la expresión de UnaG. o el CPE, lo que indica que SAFV-3 no infectó células BHK-21 (Fig. 4B). Por tanto, las células BHK-21 son insensibles a la infección por SAFV-3, probablemente debido a la ausencia de receptores de SAFV.

Susceptibilidad de líneas celulares a la infección por SAFV. (A) Las células HeLa se infectaron con SAF/UnaG o SAFV-3 recombinante de tipo salvaje (SAF404) con una MOI de 10. La fluorescencia de UnaG (verde, panel izquierdo) y el CPE se fotografiaron 24 h después de la infección. (B) Se infectaron células BHK-21 con SAF/UnaG a una MOI de 10. La fluorescencia de UnaG (verde, panel izquierdo) y el CPE se fotografiaron 24 h después de la infección. (C y D) Las células se infectaron con SAF/UnaG (C) o SAF404 (D) a una MOI de 1 y se fotografiaron (C) o se tiñeron con antisuero anti-SAFV3 (D) 16 h después de la infección para HeLa. Caco-2 y HMV-II, y a las 50 h después de la infección para las células U2OS, HCT116, BHK-21, CHO-K1 y RAW264.7. El porcentaje de células infectadas se determinó después de examinar al menos 800 células. Barra de escala, 200 μm

Investigamos más a fondo la susceptibilidad de otras líneas celulares humanas y de roedores infectándolas con una cantidad igual de SAF/UnaG. o SAF404 y evaluando la expresión del antígeno UnaG o SAFV (Ag), respectivamente. El porcentaje de células positivas para UnaG mostró una fuerte correlación con el de células positivas para SAFV Ag (Fig. 4 C y D), lo que indica que el virus SAF/UnaG puede servir como un sustituto viable para SAFV en la evaluación de la eficiencia de la infección por SAFV. . Entre las líneas celulares humanas analizadas, Caco-2, U2OS y HMV-II mostraron susceptibilidad, siendo las células HMV-II las que mostraron la mayor susceptibilidad. Por el contrario, observamos una expresión mínima de UnaG, pero detectamos una pequeña cantidad de células SAFV Ag positivas en células HCT116 (Fig. 4 C y D), lo que sugiere su baja susceptibilidad a SAFV-3. La discrepancia entre UnaG y SAFV Ag puede atribuirse a la mayor sensibilidad de la detección de SAFV Ag mediante inmunofluorescencia en células con baja susceptibilidad. En las líneas celulares de roedores RAW264.7 y CHO-K1, se observaron esporádicamente células que expresan UnaG, pero la expresión de UnaG y SAFV Ag no se extendió a las células circundantes (Fig. 4 C y D). Estos resultados indicaron que las células de roedores no son susceptibles a la infección por SAFV-3 y que existe una diferencia en la susceptibilidad a SAFV-3 entre las líneas celulares humanas. Sería interesante saber si esta diferencia en las células humanas se debe a diferencias en la expresión de los receptores de infección viral, que actualmente no están identificados, o a factores del huésped involucrados en otros procesos como la replicación viral.

A continuación, examinamos el uso potencial de SAF/UnaG para la investigación de descubrimiento de fármacos antivirales utilizando pleconaril como modelo. Pleconaril es un agente antipicornaviral que se une a la bolsa hidrofóbica ubicada en la proteína de la cápside VP1, evitando así la unión viral a las células huésped y los cambios conformacionales necesarios para el descubrimiento viral en enterovirus y rinovirus [21]. Pleconaril muestra actividad de amplio espectro contra enterovirus y rinovirus, pero se desconoce la sensibilidad de SAFV-3 al pleconaril, ya que SAFV-3 VP1 carece de la bolsa hidrofóbica [22]. Por lo tanto, examinamos el efecto antiviral de pleconaril sobre SAFV-3 utilizando el virus SAF/UnaG. Pretratamos SAF/UnaG con cantidades crecientes de pleconaril y células HeLa infectadas con una multiplicidad de infección (MOI) de 1, luego lavamos las células y las incubamos en medio nuevo durante 16 h adicionales. A las 19 h después de la infección, cuando aún no se observaba el CPE, evaluamos el efecto antiviral del pleconarilo examinando el número de células positivas para UnaG. Descubrimos que pleconaril disminuyó el número de células positivas para UnaG en concentraciones de 40 y 50 µg/ml, lo que demuestra que pleconaril inhibe la infección por SAFV-3 en células HeLa (Fig. 5). Además, el efecto antiviral del pleconaril se evaluó fácilmente mediante fluorescencia UnaG, lo que permitiría, por ejemplo, la detección de fármacos anti-SAFV de alto rendimiento utilizando un lector de microplacas de fluorescencia.

Efecto antiviral del pleconaril sobre la infección por SFV/UnaG. SAF/UnaG se trataron previamente con las concentraciones indicadas de pleconaril durante 1 h a temperatura ambiente. Las células HeLa se infectaron con SAF/UnaG pretratado a una MOI de 1 (1,25 x 105 UFP/pocillo). Las células se fotografiaron a las 19 h después de la infección. El efecto antiviral del pleconaril se evaluó mediante el número de células que expresan UnaG a las 19 h después de la infección. No se observó citotoxicidad de DMSO o pleconaril en ninguno de los pocillos.

En cuanto al mecanismo de acción del pleconaril sobre SAFV-3, Mullapudi et al. informó que el espacio entre las dos láminas β de VP1, que en algunos enterovirus contiene una cavidad hidrófoba con un factor de bolsillo, está lleno de cadenas laterales de residuos de aminoácidos que forman el núcleo proteico en SAFV-3, y señaló que es Es poco probable que se puedan utilizar inhibidores de unión de bolsillo, como pleconaril, para inhibir la infección por SAFV [22]. Sin embargo, en el presente estudio, el tratamiento previo con pleconaril inhibió la infección por SAFV-3, lo que sugiere que la unión y/o el descubrimiento viral pueden prevenirse de manera similar a los enterovirus. El pleconaril puede evitar el impedimento estérico mediante el bucle CD y unirse al bolsillo.

Generamos un SAFV-3 recombinante que expresa GFP o UnaG como gen informador y demostramos que UnaG es un marcador superior a GFP debido a su estabilidad genética durante el pase. También hemos demostrado que el virus SAF/UnaG es una herramienta útil para comparar la susceptibilidad al SAFV en varias líneas celulares y evaluar el efecto de los antivirales sobre la infección por SAFV. Recientemente, UnaG se ha utilizado para generar varios virus recombinantes que expresan reporteros, como el rotavirus en forma de proteína de fusión NSP3-UnaG y virus reportero adenoasociado [23, 24]. Así, además de SAFV y otros virus de la familia Picornaviridae, UnaG se convertirá en una proteína informadora prometedora para la visualización de la infección de una amplia variedad de virus; Los virus recombinantes que expresan UnaG serán una herramienta valiosa en la detección preliminar cualitativa de fármacos antivirales.

Se mantuvieron células HeLa (una línea celular epitelial de cáncer de cuello uterino humano), células HCT116 (una línea celular de carcinoma colorrectal humano), células U2OS (una línea celular de osteosarcoma humano) y células RAW264.7 (una línea celular similar a macrófagos de ratón) en Dulbecco. medio de Eagle modificado (Sigma-Aldrich) suplementado con suero fetal bovino (FCS) al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Las células HMV-II (una línea celular de melanoma maligno humano) se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Wako) suplementado con FCS al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Las células BHK-21 (una línea celular de fibroblastos de riñón de hámster bebé) se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle (MEM, Nissui) suplementado con 5% de suero de ternera recién nacido y 0,03% de l-glutamina. Las células Caco-2 (una línea celular de carcinoma de colon humano) se mantuvieron en MEM suplementado con 20% de FCS, 0,03% de l-glutamina y 1x aminoácidos no esenciales de MEM (Gibco). Las células CHO-K1 (una línea celular de ovario de hámster chino) se mantuvieron en medio Ham's F12 (Sigma-Aldrich) suplementado con FCS al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5%.

El marco de lectura abierto de UnaG (n.º de acceso de GenBank AB763906) se sintetizó como un fragmento de ADN (417 pb) por Integrated DNA Technologies (IDT) y el fragmento de UnaG amplificado por PCR se insertó en pBluescriptII SK(+) (Agilent) entre Sitios XhoI y HindIII, generando pUnaG/pBSKII(+).

Para construir plásmidos para proteínas indicadoras que expresan SAFV-3 recombinante, los genes UnaG y EGFP con secuencias parciales 2A y 2B se amplificaron mediante PCR utilizando pUnaG/pBSKII (+) y pEGFP-N1 (Clontech) como plantillas, respectivamente. Los fragmentos de PCR resultantes consistieron en tres porciones: el gen indicador sin el codón de iniciación, una secuencia 2B parcial que codifica PVQS en el extremo 5' y una secuencia 2A parcial que codifica DIETNPG en los extremos 3'. Además, dos fragmentos de la secuencia de SAFV-3 (JPN08-404), nt 3804 a 4206 y nt 4171 a 4972 (numeración según el número de acceso de GenBank HQ902242), se amplificaron mediante PCR utilizando el clon de ADNc infeccioso de longitud completa de SAFV-3 pSAF404. [8] como plantilla. Los tres fragmentos separados se combinaron mediante PCR de extensión por superposición. Los productos de PCR resultantes se digirieron con NcoI y ClaI y se insertaron en el pSAF404 digerido con las mismas enzimas de restricción. Estos plásmidos recombinantes fueron secuenciados y designados como pSAF/UnaG y pSAF/GFP.

Se linealizaron pSAF/UnaG y pSAF/GFP con NotI y se sintetizaron transcripciones de ARN infeccioso usando un kit de transcripción in vitro CUGA 7 (NIPPON GENE) para evitar la terminación de la transcripción de ARN en la señal de la hormona preproparatiroidea humana (PTH) en el genoma de SAFV. -3 (JPN08-404), como se describió anteriormente [8]. Para generar virus recombinantes, se sembraron células BHK-21 a una densidad de 3,0 x 105 células por placa de 35 mm. Al día siguiente, los transcritos (10 µg) se transfectaron en las células usando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) según las instrucciones del fabricante. A las 20 h después de la transfección, se recogieron células y sobrenadantes y se prepararon virus mediante tres ciclos de congelación y descongelación para liberar viriones, seguidos de centrifugación para eliminar los restos celulares. Estas reservas de sobrenadante clarificadas de células BHK-21 se denominaron pase 0 (P0). A partir de entonces, el virus se propagó en células HeLa y el lisado se preparó mediante tres ciclos de congelación y descongelación. Los títulos virales se determinaron mediante un ensayo de placa estándar en células HeLa.

La expresión del gen informador en células infectadas se capturó utilizando un analizador de células fluorescentes inteligente JULI™ (Digital Bio) o un sistema de imágenes EVOS M5000 (Thermo Fisher Scientific), con tinción nuclear utilizando Hoechst 33342 cuando fue necesario. La intensidad de la fluorescencia se midió y analizó utilizando el software EVOS M5000.

El virus SAF/UnaG o el virus SAF/GFP se pasaron en serie en células HeLa cinco veces. Las células y los sobrenadantes se recogieron de las células infectadas y luego se congelaron y descongelaron tres veces en su medio, seguido de una centrifugación para eliminar los restos celulares. El virus en el sobrenadante clarificado se pasó en serie cinco veces mediante infección secuencial de células HeLa. Los ARN virales se extrajeron del sobrenadante clarificado del primer, tercer y quinto pase (P1, P3, P5) de SAF/UnaG y P3 de SAF/GFP usando un RNeasy Mini Kit (Qiagen). Los ADNc de la primera cadena se sintetizaron utilizando la transcriptasa inversa ReverTra Ace (TOYOBO) y un cebador para SAFV-3 (5′-CTTTCATCTACAGAATTCCAACG-3'). Los ADNc obtenidos se sometieron a PCR como plantilla utilizando ADN polimerasa KOD-plus-Neo (TOYOBO) y cebadores para SAFV-3, que se hibridan con el exterior del gen indicador. Se utilizaron los siguientes pares de cebadores: GFP directo: 5′-TCAATCTACAGAGTTGATTTGTTC-3 ′ y reverso: 5′-CTCTGGTGAATTCAGTACAGTC-3 ′, UnaG directo: 5′-GCCTCTTATTACAAACAAAGACTCCAAC-3 ′ y reverso: 5′-ATTTAGTTAGCACCCCACCTTGCAACTG-3′. Los productos de PCR amplificados se analizaron en geles de agarosa al 1%.

Se evaluó la cinética de crecimiento de los virus SAF/UnaG y SAFV-3 recombinante de tipo salvaje (SAF404) en células HeLa. Las células se sembraron a una densidad de 5 x 105 células/pocillo en una placa de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h, seguido de la inoculación de cada virus con una multiplicidad de infección (MOI) de 5. Después de la adsorción del virus a 37 °C durante Durante 60 minutos, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco y se incubaron a 37 °C en DMEM con FCS al 1%. Las células y los sobrenadantes de cada cultivo se recogieron a las 0, 3, 6, 10, 24 y 48 h después de la infección. Los virus asociados a células se prepararon mediante tres ciclos de congelación y descongelación de las células. Los virus libres de células y asociados a células se valoraron mediante un ensayo de placa estándar en células HeLa.

Para la tinción por inmunofluorescencia de células infectadas con SAF404, las células se cultivaron en cubreobjetos de vidrio y se infectaron con SAF404 a 37 ˚C. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 20 min a 4 ˚C, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2% durante 15 min a temperatura ambiente y se bloquearon con leche desnatada al 5% en PBS-T durante 60 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se incubaron durante la noche a 4 °C con antisuero anti-SAFV-3 [20], se lavaron con PBS-T y luego se incubaron con IgG anti-conejo conjugada con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific) durante 60 minutos a temperatura ambiente. temperatura. Los cubreobjetos se montaron utilizando ProLong Diamond Antifade Mountant con DAPI (Thermo Fisher Scientific). Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus IX73 (Olympus) y el número de células infectadas se cuantificó utilizando el software ImageJ.

Pleconaril se obtuvo de FUJIFILM Wako Pure Chemical. Pleconaril se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO). Se sembraron células HeLa a una densidad de 4,4 x 104 células/pocillo en una placa de 48 pocillos y se incubaron durante 24 h. Se mezclaron diversas concentraciones de pleconarilo (0, 0,1, 1, 10, 20, 30, 40 y 50 µg/ml) con virus SAF/UnaG (2,75 × 105 UFP/550 µl). Se prepararon mezclas de pleconarilo/virus de modo que la concentración final de DMSO fuera del 0,5% en cada pocillo y luego se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente antes de la infección. Las células HeLa se infectaron con virus SAF/UnaG pretratado a una MOI de 1 (1,25 x 105 UFP/pocillo). Después de la adsorción del virus a 37 °C durante 3 h, se lavaron dos veces con PBS y se incubaron a 37 °C en DMEM con FCS al 10 %. A las 16 h, se fotografiaron las células que expresaban UnaG utilizando un analizador de células fluorescentes inteligente JULI ™. La actividad antiviral de pleconaril se evaluó mediante el número de células con fluorescencia UnaG.

El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism versión 7 (software GraphPad).

No aplica.

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Agradecemos a la Sra. Saito por su excelente asistencia técnica.

Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI (Número de subvención JP17K08865, JP21K07045) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia, Subvención para la Investigación Promovida de la Universidad Médica de Kanazawa (S2015-4, S2017-2, S2021-3), Subvención de Asistencia KAKEN de la Universidad Médica de Kanazawa (K2019-7, K2020-3, K2020-4).

TO y TH contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina de la Universidad Médica de Kanazawa, 1-1 Daigaku, Uchinada, Ishikawa, 920-0293, Japón

Takako Okuwa, Toshiki Himeda, Koichi Utani y Masaya Higuchi

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TO y TH diseñaron y realizaron los experimentos y redactaron el manuscrito. KU apoyó la construcción de plásmidos y los cultivos celulares. MH supervisó el estudio y editó la versión final de este manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Masaya Higuchi.

No aplica.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Okuwa, T., Himeda, T., Utani, K. et al. Generación de un Virus Saffold recombinante que expresa UnaG como marcador para la visualización de infección viral. VirolJ 20, 175 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02142-8

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Recibido: 14 de febrero de 2023

Aceptado: 26 de julio de 2023

Publicado: 07 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02142-8

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