Haemophilus influenzae no tipificable liberado de la residencia de una biopelícula por un anticuerpo monoclonal dirigido contra un componente de la matriz de la biopelícula muestra un fenotipo vulnerable

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12959 (2023) Citar este artículo

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Las biopelículas bacterianas contribuyen significativamente a la patogénesis, recurrencia y/o cronicidad de la mayoría de las enfermedades bacterianas debido a su notable reticencia a la eliminación. En este documento, examinamos la cinética de la sensibilidad mejorada de Haemophilus influenzae (NTHI) no tipificable recién liberado (NRel) de la residencia en biopelícula por un anticuerpo monoclonal contra una proteína bacteriana DNABII (α-DNABII) a la muerte preferencial por un antibiótico β-lactámico. Este fenotipo se detectó en 5 minutos y duró aproximadamente 6 h. La expresión relativa de genes seleccionados debido a su conocida participación en la sensibilidad a un β-lactámico mostró una expresión regulada positivamente transitoria de proteínas de unión a penicilina por α-DNABII NTHI NRel, mientras que hubo una expresión limitada del precursor de β-lactamasa. La expresión transitoria regulada a la baja de mediadores del estrés oxidativo apoyó una vulnerabilidad en un momento similar a la muerte intracelular sensible a la NADPH-oxidasa por parte de PMN humanos activados. Además, la expresión transitoria regulada positivamente de la principal porina NTHI se alineó bien con el aumento observado de la permeabilidad de la membrana de α-DNABII NTHI NRel, una característica que también muestra NRel de tres patógenos adicionales. Estos datos proporcionan información mecanicista sobre el fenotipo transitorio, aunque altamente vulnerable, de α-DNABII NRel. Esta mayor comprensión respalda la validación continua de este novedoso enfoque terapéutico diseñado para aprovechar el conocimiento del fenotipo α-DNABII NRel para una erradicación más eficaz de enfermedades recalcitrantes relacionadas con biopelículas.

Las biopelículas bacterianas contribuyen significativamente a la patogénesis de infecciones agudas y crónicas1, así como a la recurrencia y resistencia al tratamiento de muchas enfermedades2. Las enfermedades comunes en las que las biopelículas desempeñan un papel clave incluyen la otitis media, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la periodontitis y la fibrosis quística, entre muchas otras3,4,5. La tolerancia canónica a las biopelículas es atribuible a múltiples factores, pero lo más importante, y desde el punto de vista de la resolución de la enfermedad, es que las bacterias dentro de una biopelícula son altamente resistentes tanto a los antibióticos como a los efectores inmunes del huésped6,7,8. De hecho, las bacterias residentes en biopelículas son hasta 1000 veces más resistentes a los antibióticos convencionales en comparación con sus contrapartes cultivadas planctónicamente9,10,11. Además, las infecciones que involucran biopelículas son costosas; Se estima que la carga económica mundial de las biopelículas relacionadas con los costos médicos y de atención sanitaria humana fue de aproximadamente 387 mil millones de dólares en 201912.

Para tratar eficazmente estas enfermedades comunes y altamente resistentes relacionadas con las biopelículas, se necesitan estrategias novedosas. Muchos laboratorios están trabajando para lograr estos objetivos13,14,15,16,17,18. En este sentido, nuestro laboratorio desarrolló un enfoque basado en anticuerpos monoclonales dirigidos que libera eficazmente las bacterias residentes en biopelículas de su matriz estructural protectora para que puedan ser eliminadas más fácilmente por los efectores inmunes del huésped y/o los antibióticos tradicionales. Para ello, nos centramos específicamente en un componente estructural ubicuo de la matriz de la biopelícula bacteriana: las proteínas de unión al ADN bacteriano conocidas como familia DNABII. Las dos proteínas DNABII, la proteína similar a histonas (HU) y el factor de integración del huésped (IHF), se unen y doblan el ADN bicatenario19,20,21. Las proteínas DNABII se ubican en los vértices de las hebras cruzadas de ADN extracelular (ADNe) dentro de la matriz de la biopelícula, donde sirven como proteínas clave que brindan soporte estructural crítico al andamio de ADNe en forma de red22. Cuando se incuban biopelículas formadas in vitro por diversos patógenos humanos con anticuerpos dirigidos contra una proteína DNABII nativa o un inmunógeno peptídico sintético "quimero de puntas" que diseñamos para imitar las "puntas" inmunoprotectoras de unión al ADN de una proteína DNABII, el equilibrio inducido El cambio produce un rápido colapso de la biopelícula con la liberación concomitante de bacterias residentes en la biopelícula22,23,24,25.

Los anticuerpos anti-DNABII también han demostrado su potencial disruptivo, así como su eficacia para la resolución de enfermedades, en tres modelos preclínicos de enfermedades humanas. El tratamiento terapéutico con anticuerpos anti-DNABII eliminó las biopelículas agregadas de Pseudomonas aeruginosa del pulmón murino24 y resolvió las biopelículas mucosas adherentes formadas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans en un modelo de periimplantitis osteolítica en ratas26. Además, cuando se introducen en el oído medio de chinchillas, fragmentos de unión a antígeno (p. ej., Fabs) derivados del quimero de punta DNABII humanizado dirigieron la resolución mediada monoclonal de biopelículas mucosas en un modelo de otitis media inducida por Haemophilus influenzae (NTHI) no tipificable27. Desde un punto de vista preventivo, cuando se utiliza como vacunógeno, la inmunización activa con el péptido quimérico de punta induce la formación de anticuerpos in situ que interrumpen las biopelículas existentes formadas por NTHI en el oído medio de la chinchilla y median en la resolución rápida de la enfermedad sin necesidad de antibióticos25.

Independientemente del método preciso utilizado, varios laboratorios informan que las bacterias recién liberadas de la residencia en biopelículas exhiben un fenotipo distinto, aunque transitorio, de mayor sensibilidad a la muerte mediada por antibióticos18,28,29,30,31,32,33. Además de ser más sensibles a la destrucción que aquellas que residen en biopelículas, como se esperaba, una característica comúnmente observada y convincente de las bacterias recién liberadas de su fortaleza de biopelículas es que esta sensibilidad notablemente mayor a la destrucción mediada por antibióticos también se observa en comparación con las bacterias que residen en biopelículas. sus contrapartes cultivadas planctónicamente, estas últimas han sido consideradas hasta ahora el estilo de vida bacteriano más sensible a los antibióticos23,30,31,34,35,36.

Curiosamente, cuando evaluamos la susceptibilidad del NTHI recién liberado (NRel) de la residencia en biopelículas a la destrucción por dos antibióticos comúnmente utilizados para tratar a individuos con enfermedades del tracto respiratorio inducidas por NTHI, [p. ej., amoxicilina más ácido clavulánico (A/C) o trimetoprima más sulfametoxazol (T/S)], los NRel inducidos por una proteína monoclonal anti-DNABII (α-DNABII) fueron preferentemente significativamente más sensibles a A/C (y no a T/S) que sus homólogos planctónicos36. Además, el análisis proteómico completo reveló que α-DNABII NTHI NRel exhibió un perfil de expresión proteómica distinto en comparación con el NTHI cultivado planctónicamente en fase logarítmica media, como lo demuestra el análisis de componentes principales36. Además, y en relación con el nuevo trabajo presentado aquí, α-DNABII NTHI NRel exhibió un aumento o disminución significativo > 1,5 veces en la abundancia de 103 proteínas expresadas diferencialmente en comparación con el NTHI36 planctónico.

Aquí buscamos definir mejor la cinética del fenotipo α-DNABII NTHI NRel de sensibilidad preferencial a la muerte por un antibiótico β-lactámico, específicamente qué tan rápido se desarrolla y cuánto tiempo dura. También estábamos interesados ​​en comenzar a determinar los mecanismos moleculares que podrían subyacer a esta sensibilidad, así como las características biológicas relacionadas de la población α-DNABII NRel. Con este objetivo, utilizamos la cepa NTHI 86-028NP37,38, bien caracterizada, originalmente aislada de la nasofaringe de un niño al que se le insertó un tubo de timpanostomía debido a otitis media crónica, como organismo modelo para definir y caracterizar aún más el α-DNABII. Fenotipo NRel de este patógeno predominante del tracto respiratorio.

Mientras que trabajos anteriores mostraron que NTHI NRel mostraba una destrucción preferencial por un antibiótico β-lactámico que por una sulfonamida después de 15 mo 2 h de exposición a α-DNABII36, aquí buscamos definir más claramente la cinética de este resultado. Como tal, después de la incubación de una biopelícula de NTHI de 16 h con α-DNABII durante 1 m, 5 m, 15 m, 2 h, 4 h o 6 h, analizamos la destrucción de NTHI NRel mediante A/C o T/S ( Figura 1)39. Las concentraciones de antibióticos utilizadas se incrementaron con el tiempo para ajustar el crecimiento bacteriano en el sistema de cultivo en el momento en que se recolectaron las bacterias (Tabla 1), mientras que simultáneamente se mantuvo la destrucción de NTHI que creció planctónicamente en los fluidos por encima de las biopelículas en ~ 15-25% para permitir detección de cualquier aumento de la sensibilidad de NRel. El número (UFC/ml) de NTHI que creció planctónicamente en un medio por encima de la biopelícula o el de NTHI liberado de la residencia de la biopelícula por α-DNABII después del período de tiempo indicado se enumera en la Tabla complementaria S1. La relación relativa de recuperación de α-DNABII NTHI NRel con respecto a la de aquellos que crecieron planctónicamente en el medio por encima de la biopelícula osciló entre 1,3:1 y 2,4:1, similar a lo que informamos anteriormente40.

Perfil cinético de sensibilidad a los antibióticos de α-DNABII NTHI NRel a A/C o T/S. Las concentraciones de antibióticos utilizados se predeterminaron para mantener la destrucción de las bacterias que crecieron planctónicamente en los fluidos que recubren una biopelícula en nuestro sistema de cultivo (por ejemplo, 'plancha' en clave) entre ~ 15 y 25 % para permitirnos detectar fácilmente cualquier destrucción mejorada del α-DNABII NTHI NRel (por ejemplo, 'α-DNABII NRel' en clave). Dentro de los 5 m de la exposición de la biopelícula a α-DNABII, NTHI NRel demostró una destrucción significativamente mayor por aire acondicionado que el NTHI planctónico (p ≤ 0,01). A los 15 m, α-DNABII NTHI NRel alcanzó el mayor nivel de destrucción significativamente mayor por A/C en comparación con el NTHI planctónico (p ≤ 0,0001). La susceptibilidad general al aire acondicionado alcanzó su punto máximo a las 2 h de exposición de biopelículas a α-DNABII (p ≤ 0,0001) y permaneció significativamente aumentada a las 4 h de exposición de biopelículas a α-DNABII (p ≤ 0,0001). Por el contrario, la muerte mediada por T/S de α-DNABII NTHI NRel permaneció en ~ 25% o menos durante todo el período del ensayo y nunca fue estadísticamente mayor que la muerte de bacterias planctónicas por T/S. La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores con la prueba de comparaciones múltiples de Šidák. **p ≤ 0,01; ****p ≤ 0,0001. Los datos se representan como media ± SEM. Los datos mostrados son representativos de tres ensayos separados, cada uno realizado en días separados, con 2 a 3 réplicas técnicas por ensayo.

En cada momento analizado, la destrucción mediada por T/S de α-DNABII NTHI NRel nunca superó el 25 %, lo que coincide con nuestro informe anterior de susceptibilidad relativa mínima a este antibiótico cuando se probó en α-DNABII NRel recuperado a los 15 mo 2 h36. La destrucción de α-DNABII NTHI NRel por T/S fue mayor a los 5 y 15 m, pero disminuyó a las 2 h y permaneció en o por debajo del 20% tanto a las 4 h como a las 6 h. La destrucción de α-DNABII NTHI NRel por T/S nunca fue significativamente mayor que la de NTHI planctónico por T/S.

Por el contrario, la sensibilidad de α-DNABII NTHI NRel a la destrucción por aire acondicionado fue significativamente mayor que la del NTHI planctónico dentro de 5 m (p = 0,003). Esta sensibilidad preferencial al antibiótico β-lactámico alcanzó su punto máximo dentro del NRel recuperado después de la exposición de la biopelícula a α-DNABII durante 2 h (p = 0,0001), un grado de diferencia significativa que se mantuvo en el punto de tiempo de 4 h (p <0,0001). A las 6 h, la susceptibilidad de α-DNABII NTHI NRel a la muerte por A/C no fue diferente a la de la muerte planctónica por A/C o T/S.

Dado que los NTHI NRel recuperados en el momento de las 2 h eran significativamente sensibles a la destrucción por aire acondicionado, mientras que los recuperados en el momento de las 6 h habían perdido esta característica específica, a continuación nos centramos en la evaluación comparativa de estas dos poblaciones de NRel para comenzar a determinar qué podría contribuir a la notable sensibilidad mejorada del aire acondicionado.

Para comenzar a determinar las diferencias relativas en la sensibilidad a la muerte por A/C entre 2 h α-DNABII NTHI NRel ('2 h NRel') y aquellos recuperados a las 6 h ('6 h NRel'), que ya no presentaban esta característica , establecimos un conjunto de 15 pares de cebadores (Tabla complementaria S2) diseñados para caracterizar específicamente la sensibilidad a un antibiótico β-lactámico mediante PCR de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR).

El primer subconjunto perfilado son tres genes canónicos en fase de retraso (fis, deaD y artM), utilizados aquí como en trabajos anteriores donde demostramos que NTHI NRel recuperado después de 15 m de exposición de biopelícula a α-DNABII exhibió una abundancia de proteínas ribosómicas características de bacterias en fase de retraso y significativamente (p ≤ 0,05) mayor abundancia de transcripción de estos tres genes en comparación con NTHI planctónico36,41. Por lo tanto, ahora nos preguntamos si el NRel de 2 h, que mostró sensibilidad preferencial al aire acondicionado, probablemente todavía estaba en la fase de retraso pero ya no lo estaba en el momento de las 6 h. De hecho, estos tres genes canónicos de fase de retraso exhibieron una abundancia significativa de aproximadamente 4 a ocho veces mayor a las 2 h en comparación con las 6 h (Fig. 2). Por lo tanto, estos datos proporcionaron evidencia adicional de que tras la liberación de la residencia de la biopelícula por α-DNABII, NTHI NRel parecía imitar a las bacterias en la fase de latencia dentro de los 15 minutos y hasta al menos 2 h después de la liberación.

α-DNABII NTHI NRel de 2 h y 6 h fueron distintos en la transcripción relativa de un panel de genes cuyos productos se sabe que están involucrados en la sensibilidad a un antibiótico β-lactámico. Mediante qRT-PCR, α-DNABII NTHI NRel de 2 h y 6 h fueron transcripcionalmente distintos mediante el análisis de 15 genes perfilados específicos. 11 de los 15 genes perfilados estaban significativamente (> doble cambio) regulados positivamente y dos genes estaban significativamente regulados negativamente en 2 h α-DNABII NTHI NRel en comparación con NRel recolectado después de 6 h. Los datos se representan como media ± SEM. El análisis de cada gen se realizó al menos tres veces en días separados con 2 a 3 triplicados técnicos por ensayo. [Nota: MDEP – bomba de eflujo multifármaco].

A continuación, evaluamos la expresión relativa de ompP2, que codifica OMP P2, la principal porina de la membrana externa de NTHI42,43, ya que esta porina probablemente esté involucrada en el acceso de A/C a la célula bacteriana. En relación con 6 h NRel, 2 h NRel exhibió un aumento significativo de casi diez veces la expresión de ompP2. Por lo tanto, este hallazgo también proporcionó un mecanismo potencial para la muerte significativamente mayor observada de 2 h NRel por A/C, que ya no se observó a las 6 h.

El siguiente conjunto de tres genes (p. ej., ftsl, dacA y dacB) codifican proteínas transportadoras de penicilina (PBP) bacterianas, que son objetivos de los antibióticos β-lactámicos44,45,46,47,48. Encontramos un aumento significativo de tres veces en la expresión de cada gen PBP en 2 h NRel en comparación con 6 h NRel, un hallazgo que nuevamente sugirió un mecanismo potencial para el aumento observado de la sensibilidad a A/C que fue detectable poco después de la liberación de la residencia de la biopelícula por α -DNABII.

A continuación, evaluamos la expresión relativa de tres genes de la bomba de eflujo de múltiples fármacos (MDEP) AcrAB-TolC debido a su papel en la eliminación de antibióticos de la célula bacteriana49. Encontramos una expresión significativamente mayor (≥ cuatro veces) de cada uno de estos tres genes en 2 h frente a 6 h NRel, lo que sugirió una mayor actividad de esta bomba de eflujo en el momento de 2 h. Curiosamente, sin embargo, el gen que codifica el represor de esta bomba de eflujo, acrR, también se reguló significativamente (11 veces) en 2 h NRel. Dada la naturaleza paradójica de estos hallazgos con respecto a la importante sensibilidad A/C, consideramos si la recolección de ARN en el momento exacto en el que se evaluó la actividad biológica de la muerte relativa por antibióticos (p. ej., 2 o 6 h) podría haber proporcionado una "instantánea en el tiempo" equivocada para medir la actividad real de estos productos genéticos en particular.

Como tal, también recuperamos ARN después de 30 m de exposición de biopelícula a α-DNABII (Figura complementaria S1) como quizás un mejor sustituto de la actividad comparativa del producto genético. Encontramos una abundancia de transcripciones significativamente mayor para acrA, acrG y tolC a 30 m en relación con 2 h (p = 0,004 para acrA o p = 0,0005 para acrG y tolC). Además, hubo una abundancia de transcritos de acrR significativamente mayor a los 30 m en comparación con las 2 h (p ≤ 0,0001). Desafortunadamente, estos datos adicionales no ofrecieron claridad en cuanto al papel de esta bomba de eflujo en la mayor sensibilidad observada de α-DNABII NRel en esta cepa de NTHI a A/C, pero sugirieron que en general el resultado biológico relativo neto de estos cuatro genes Los productos favorecieron la actividad del represor, como otros han observado de manera similar30. Sin embargo, también es posible que el papel de AcrR no esté claro en esta cepa. Además, es importante señalar que la sensibilidad temporal de los cambios en la expresión genética y cómo eso podría relacionarse con la expresión relativa de proteínas y/o la estabilidad o vida útil de estos productos genéticos (así como probablemente otros) potencialmente desempeñaron papeles adicionales aquí.

Mientras que utilizamos amoxicilina con el inhibidor de la β-lactamasa ácido clavulánico, dada la sensibilidad significativa observada a la destrucción por A/C en 2 h NRel, estábamos interesados ​​en la expresión relativa de bla, que codifica el precursor de la β-lactamasa NTHI. No encontramos diferencias significativas entre el NRel de 2 h y el de 6 h, lo que sugirió que este producto genético probablemente no jugó ningún papel en la sensibilidad transitoria significativa al A/C observada.

Por último, perfilamos tres genes implicados en la resistencia bacteriana al estrés oxidativo, hktE, pdgX y sodA, dada la rápida eficacia previamente demostrada de α-DNABII cuando se utiliza terapéuticamente en tres modelos preclínicos de enfermedades humanas sin la adición de antibióticos24,26. 27, teníamos curiosidad sobre la posible vulnerabilidad de NTHI NRel para albergar efectores inmunes innatos además de los antibióticos. Mientras que no hubo diferencias significativas en la expresión relativa del gen sodA, hktE y pdgX se regularon significativamente a la baja en ≥ cuatro veces en 2 h NRel en comparación con 6 h NRel. Este resultado sugirió que el fenotipo α-DNABII NTHI NRel también podría incluir estar menos equipado para mitigar el estrés oxidativo. Por lo tanto, ahora queríamos determinar la sensibilidad relativa de NRel de 2 h frente a 6 h a la muerte por PMN humanos.

Para evaluar la capacidad relativa de los PMN humanos activados para matar NRel de 2 h frente a 6 h, introdujimos el uso de la versión humanizada de nuestro anticuerpo monoclonal quimérico anti-punta ('HuTipMab')50, mientras continuamos usando el monoclonal murino (α- DNABII) que habíamos utilizado hasta este punto, pero ahora nos referiremos a él como 'MsTipMab' para mayor claridad. Esta comparación directa de HuTipMab con MsTipMab nos permitió ampliar nuestra evaluación sobre si la humanización comprometía alguna actividad evaluada de este monoclonal, incluida la inducción del fenotipo NRel. Descubrimos que, mientras que la susceptibilidad del NTHI planctónico a la destrucción por PMN humanos era ~ 33% (Fig. 3A, símbolos de recuadro abierto), la de 2 h NTHI NRel, ya sea inducida por Ms- o HuTipMab, era significativamente mayor (65% o 62%, respectivamente, p ≤ 0,0001) (Fig. 3A).

2 h α-DNABII NTHI NRel fueron significativamente susceptibles a la destrucción intracelular sensible a NADPH-oxidasa por parte de PMN humanos. Aquí determinamos la capacidad relativa de los PMN humanos activados para matar planctónico isogénico, 2 ho 6 h α-DNABII NTHI NRel. (A) En el momento de las 2 h, ~ 33% de los NTHI planctónicos fueron eliminados por PMN humanos activados. Sin embargo, independientemente de si fueron inducidos por MsTipMab o HuTipMab, los NTHI NRel fueron significativamente (p ≤ 0,0001) más susceptibles a la muerte por PMN humanos, como lo demuestra una muerte de ~ 65% y ~ 62%, respectivamente. El tratamiento con DPI de PMN humanos redujo significativamente la susceptibilidad a NTHI NRel de 2 h, ya sea inducido por MsTipMab o HuTipMab, como lo demuestra la muerte a ~ 35 % o ~ 32 % respectivamente (p ≤ 0,001). (B) A las 6 h, el uso de DPI para inhibir la NADPH-oxidasa intracelular no afectó la capacidad relativa de los PMN humanos activados para matar el NRel inducido por MsTipMab o HuTipMab. No hubo diferencias en la susceptibilidad a la muerte por PMN tratados con DPI para NTHI planctónico en relación con 2 h NRel o en relación con 6 h NRel (p > 0,05). Las líneas rojas indican la media. La significación estadística que compara los NTHI planctónicos destruidos por PMN no tratados o tratados con DPI se determinó mediante una prueba t de dos colas no apareada o un ANOVA de dos vías con corrección de Šidák (Paneles AB). ***p ≤ 0,001; ****p ≤ 0,0001. Los datos presentados son el porcentaje medio de muertes de al menos seis ensayos separados, cada uno realizado en días separados con dos o tres réplicas técnicas por punto de datos.

Para determinar a continuación si la destrucción mejorada de 2 h NRel por parte de los PMN humanos fue probablemente el resultado de su capacidad relativa limitada para mitigar el estrés oxidativo (debido a una importante regulación negativa de hktE y pdgX), incorporamos el inhibidor intracelular de NADPH-oxidasa cloruro de difenilenoyodonio. (DPI)51 en nuestro ensayo de eliminación de PMN. Cuando los neutrófilos se incubaron con DPI, 2 h NRel inducido por Ms- o HuTipMab ahora eran significativamente menos susceptibles a la muerte (35% y 32%, respectivamente, p = 0,0006) en comparación con la muerte por PMN no tratados (Fig. 3A, negro cerrado y círculos grises). En particular, independientemente de si fue inducida por incubación con Ms o HuTipMab, la destrucción de NRel de 2 h por PMN tratados con DPI ya no fue estadísticamente significativamente diferente de la del NTHI planctónico por PMN pretratados (p = 0,36). El DPI no tuvo ningún efecto sobre la destrucción del planctónico.

En NRel de 6 h, el tratamiento con DPI no tuvo ningún efecto sobre la capacidad relativa de los PMN humanos para matar estas bacterias una vez fagocitadas, ya que no hubo diferencias significativas en la susceptibilidad a la destrucción por los PMN tratados con DPI en comparación con los PMN no tratados (p = 0,3) ( Figura 3B). Como se observó en el ensayo de NRel de 2 h, no hubo diferencias en la susceptibilidad a la muerte por PMN de NTHI planctónico tratados con DPI en relación con NRel de 6 h (p = 0,10), y la muerte de NTHI planctónico no pareció verse afectada en gran medida por la adición de DPI. lo que sugirió una mayor influencia de los mecanismos extracelulares de muerte mediada por PMN para el NTHI planctónico. Además, no hubo diferencias en la susceptibilidad a la muerte por PMN tratados con DPI en 2 h en comparación con 6 h NRel (p = 0,07).

En conjunto, estos datos indicaron que, además de la sensibilidad transitoria, aunque notablemente aumentada, a la destrucción por A/C, los α-DNABII NTHI NRel también eran altamente vulnerables a la destrucción intracelular por PMN humanos activados, y específicamente de una manera sensible a la NADPH-oxidasa. . Esta característica ya no se detectó en 6 h NRel, lo que sugirió otra vulnerabilidad transitoria de este fenotipo.

Dado que ompP2 estaba significativamente regulado positivamente en 2 h NRel en comparación con 6 h NRel, nos preguntamos si este aumento de la expresión de la principal porina de la membrana externa NTHI podría correlacionarse con una mayor permeabilidad de la membrana. Para abordar esto, utilizamos el tinte fluorescente verde intercalante de ácido nucleico, SYTOX Green. SYTOX Green solo puede acceder al genoma NTHI si las membranas interna y externa de esta bacteria Gram-negativa son permeables, por lo que se utilizó una señal de fluorescencia aumentada como sustituto de la permeabilidad relativa de la membrana externa.

En un ensayo de NRel de 2 y 6 h, el control negativo (NTHI cultivado planctónicamente en fase logarítmica media) fue mínimamente fluorescente inmediatamente después de la exposición a SYTOX Green, luego mantuvo este bajo nivel de fluorescencia durante todo el período de ensayo de 120 m (Fig. .4A y B, líneas negras). Por el contrario, el control positivo (NTHI cultivado planctónicamente en fase logarítmica media y tratado con Triton X-100 para permeabilizar artificialmente la membrana bacteriana) también demostró un nivel bajo de fluorescencia en el tiempo cero, pero luego aumentó rápidamente para alcanzar y mantener una fluorescencia máxima de ~ 0,0125. RFU/CFU dentro de aproximadamente 30 a 45 m (Fig. 4A y B, líneas grises). El NRel de 2 h también demostró un nivel bajo de fluorescencia inmediatamente después de la exposición a SYTOX Green, pero luego aumentó constantemente con el tiempo hasta alcanzar una meseta máxima a 75 m que se acercó a la del control positivo (Fig. 4A, línea verde). A lo largo del ensayo, 2 h NRel tuvo consistentemente una fluorescencia significativamente mayor que el NTHI cultivado planctónicamente (p ≤ 0,0001), lo que sugirió una mayor permeabilidad de la membrana externa en 2 h NRel.

La permeabilidad de la membrana bacteriana fue significativamente mayor en α-DNABII NRel de 2 h en comparación con aquellos que fueron cultivados planctónicamente para NTHI más tres patógenos humanos adicionales. La fluorescencia relativa emitida se midió mediante el colorante intercalante de ácido nucleico SYTOX Green como indicador para evaluar la permeabilidad de la membrana externa de α-DNABII NRel. En cada ensayo, las bacterias cultivadas planctónicamente con o sin tratamiento con Triton X-100 sirvieron como controles positivos y negativos, respectivamente. (A) 2 h α-DNABII NTHI NRel fueron significativamente (p ≤ 0,0001) más fluorescentes durante el período de ensayo de 120 m que el control negativo. (B) A las 6 h, la fluorescencia exhibida de α-DNABII NTHI NRel se parecía a la del NTHI cultivado planctónicamente. El aumento observado de la permeabilidad de la membrana de 2 h pero no de 6 h α-DNABII NTHI NRel apoyó la sensibilidad transitoria y significativamente mayor observada de 2 h NRel al aire acondicionado que ya no se observó en la población de 6 h NRel. (CE) Para determinar si el aumento de la permeabilidad de la membrana externa podría ser una característica más universal de α-DNABII NRel, también evaluamos la permeabilidad de la membrana de α-DNABII NRel de 2 h generada de manera idéntica de dos patógenos gramnegativos adicionales y un patógeno grampositivo. α-DNABII E. coli NRel (Panel C) exhibió una fluorescencia significativamente mayor (p ≤ 0,01) en comparación con el control negativo, al igual que α-DNABII P. aeruginosa NRel (Panel D) (p ≤ 0,01) y MRSA NRel (Panel E ) (p ≤ 0,05). Los datos se presentan como media ± SEM. Los datos representan tres ensayos separados realizados en tres días separados con tres triplicados técnicos por ensayo. Las unidades de fluorescencia relativas (RFU) se normalizaron a las CFU de la población bacteriana respectiva añadida a la placa de ensayo. Los análisis estadísticos de las respectivas series por triplicado se calcularon mediante un modelo mixto lineal de medidas repetidas para comparar los datos del curso temporal entre los valores de NRel versus los del control negativo.

Dado que 6 h NRel demostró una sensibilidad limitada a A/C o T/S (ver Fig. 1), estos 6 h NRel también se analizaron para determinar su permeabilidad relativa de la membrana externa (Fig. 4B). Mientras que el NTHI planctónico (con y sin tratamiento con Triton X-100) se comportó como se describe en la Fig. 4A, el NRel de 6 h ahora emitió una señal de fluorescencia solo ligeramente mayor que el NTHI cultivado planctónicamente en fase logarítmica media durante todo el período de ensayo de 120 m (p = 0,11). ). Estos datos sugirieron que, en consonancia con una mayor sensibilidad al aire acondicionado, el aumento de la permeabilidad de la membrana externa observado en 2 h NRel también fue transitorio y se resolvió a las 6 h.

Para garantizar que el aumento de la permeabilidad de la membrana externa observado no fuera una característica NRel exclusiva de NTHI en su conjunto o de este aislado de NTHI en particular, también evaluamos el NRel generado de manera idéntica de tres patógenos adicionales [Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa o un meticilina- Staphylococcus aureus resistente (MRSA)] inducido tras la exposición de las respectivas biopelículas de 16 h a α-DNABII durante 2 h. Mientras que cada bacteria demostró un patrón único, 2 h α-DNABII NRel de E. coli, P. aeruginosa y MRSA exhibieron una señal de fluorescencia significativamente mayor (p = 0,007 para E. coli NRel, p = 0,005 para P. aeruginosa NRel, p = 0,02 para MRSA NRel) en comparación con sus homólogos cultivados planctónicamente durante el período de ensayo de 120 m (Fig. 4C-E). Estos datos sugirieron que un fenotipo transitorio de aumento de la permeabilidad de la membrana externa era potencialmente una característica común de las bacterias liberadas de la residencia en biopelículas por la acción de un anticuerpo monoclonal dirigido contra las proteínas estructurales de la matriz de biopelículas DNABII.

No se puede subestimar la necesidad de enfoques terapéuticos más eficaces, o preferiblemente estrategias de prevención, para combatir las enfermedades persistentes relacionadas con las biopelículas. Las enfermedades relacionadas con las biopelículas exacerban la importante crisis mundial de salud pública de la resistencia a los antibióticos, ya que a pesar de que las bacterias residentes en las biopelículas son significativamente recalcitrantes al tratamiento con antibióticos, a las personas con estas enfermedades se les recetan antibióticos comúnmente como parte de nuestro muy limitado repertorio de opciones de tratamiento52 ,53,54. Las bacterias que residen dentro de las biopelículas no sólo son altamente resistentes a los antibióticos, sino que la resistencia de las biopelículas a la eliminación por parte de efectores inmunes agrega complejidad al desafiar significativamente la capacidad del huésped para resolver enfermedades relacionadas con las biopelículas55,56,57. Para abordar estos problemas, una de esas estrategias incluye el uso de metodologías que puedan liberar a las bacterias residentes en biopelículas de su fortaleza protectora para facilitar su destrucción por parte del huésped y, si es necesario, mediante la administración conjunta de antibióticos tradicionales que ahora pueden ser sustancialmente más efectivos. .

Para lograr este objetivo, nos hemos centrado en un componente estructural clave de la matriz de la biopelícula bacteriana: las proteínas bacterianas de unión al ADN de la familia DNABII19,20,21. Las dos proteínas DNABII, HU e IHF, se unen a hebras cruzadas de ADN extracelular en la matriz de la biopelícula, estabilizando así eficazmente esta estructura22. Cuando incubamos una biopelícula formada individualmente o por dos de cualquiera de los seis patógenos diversos del tracto respiratorio, así como cualquiera de los miembros altamente resistentes a los antibióticos de los patógenos ESKAPEE, con un anticuerpo monoclonal dirigido contra las "puntas" protectoras de unión al ADN. de una proteína DNABII, la biopelícula colapsa rápidamente22,23,24,25,40. Este colapso libera a todos los patógenos residentes en biopelículas probados a un estado altamente vulnerable, pero transitorio, en el que ahora son significativamente más susceptibles a los antibióticos comúnmente utilizados de múltiples clases in vitro, y también a los efectores inmunes innatos in vivo24,25,26,27. 35,36,58,59. Esta susceptibilidad mejorada se observa no sólo en comparación con sus homólogos isogénicos residentes en el estado de biopelícula, sino que, lo que es más importante, también es mayor que en los del estado planctónico.

Específicamente, en un informe anterior, demostramos que después de la incubación de una biopelícula formada por un aislado clínico de NTHI con α-DNABII durante 15 minutos o 2 h, los NRel resultantes eran significativamente más susceptibles a ser destruidos por A/C que antes. hasta matar por T/S36. En general, no era inesperado que los NRel fueran más sensibles a la matanza que sus homólogos residentes en biopelículas. Sin embargo, fue notable que estos NRel fueran igual o significativamente más sensibles a cualquiera de los antibióticos que sus contrapartes isogénicas cultivadas planctónicamente36. Aquí, investigamos más a fondo la mayor sensibilidad preferencial observada de NRel a la muerte por el antibiótico β-lactámico A/C, que por la sulfonamida, T/S.

En conjunto, los datos presentados aquí revelaron más claramente la cinética del fenotipo α-DNABII NRel sensible a A/C después de la liberación de su residencia en una biopelícula formada por la cepa NTHI 86-028NP mediante un monoclonal murino dirigido contra una proteína de matriz estructural de biopelícula de DNABII. familia. Descubrimos que esta sensibilidad significativa es detectable en 5 minutos y dura aproximadamente 6 h in vitro, después de lo cual la población NRel ya no es selectivamente más sensible al A/C.

El examen de la expresión relativa de varios genes cuyos productos se sabe que contribuyen a la sensibilidad a los β-lactámicos reveló múltiples factores que probablemente contribuyeron al aumento de la susceptibilidad de α-DNABII NTHI NRel al A/C. En trabajos anteriores, demostramos que dentro de los 15 minutos posteriores a la liberación de la residencia de la biopelícula por anti-DNABII, los NTHI exhiben una mayor expresión de genes característicos de las bacterias en la fase de latencia, un período durante el cual las bacterias participan en la reparación de sus envolturas y membranas celulares, y por lo tanto también son más permeables a la membrana41,60. Aquí, confirmamos que en el momento de las 2 h, α-DNABII NTHI NRel todavía parecía imitar a las bacterias en la fase de retraso, como lo demuestra una regulación positiva significativa de los mismos tres genes canónicos de la fase de retraso en comparación con el NRel recuperado en el momento de las 6 h. punto. El hecho de que α-DNABII NTHI NRel nunca haya mostrado una susceptibilidad significativamente mayor a T/S probablemente se explica por el entendimiento de que las bacterias en fase de latencia no son muy activas en la síntesis de proteínas (un objetivo para la clase de antibióticos de sulfonamida, como T/S)61. 62,63.

En datos anteriores de nuestro grupo36, el análisis proteómico completo de α-DNABII NRel de 15 minutos mostró un aumento en la proteína de síntesis de peptidoglicano, MurB, lo que sugiere una composición alterada de la envoltura celular36,64. La modificación en la envoltura celular α-DNABII NTHI NRel fue corroborada aún más por los nuevos resultados mostrados aquí de una mayor abundancia de transcripción de ompP2, que codifica la porina principal de la membrana externa de NTHI, proporcionando así un mecanismo para la entrada de antibióticos en la célula bacteriana. Además, este aumento de la expresión de ompP2 se alineó con nuestra demostración concomitante de un aumento transitorio en un momento similar en la permeabilidad de la membrana externa en NTHI recién liberado en el momento de 2 h, como lo demuestra la fluorescencia relativa tras la incubación con SYTOX Green.

Los nuevos datos presentados aquí también demostraron que se espera que aumentos significativos en la expresión relativa de tres PBP perfiladas también hayan contribuido a la mayor sensibilidad a los antibióticos mostrada por α-DNABII NTHI NRel, ya que los β-lactámicos se dirigen a las PBP44,45,46. De hecho, específicamente para el aumento relativo de la expresión del gen ftsI de H. influenzae, las bacterias que han desarrollado mutaciones en la región transpeptidasa de esta proteína codificada demuestran una mayor resistencia a los β-lactámicos44,45,46,47,48. Por último, α-DNABII NTHI NRel de 2 h mostró una expresión limitada de bla, el precursor de la β-lactamasa, lo que sugirió otro posible contribuyente a la sensibilidad significativa a la destrucción por A/C, ya que incluso en ausencia de ácido clavulánico, NTHI NRel tendría una capacidad limitada para degradar este antibiótico una vez que hubiera entrado en la célula65. El hecho de que los NTHI recién liberados de su fortaleza protectora de biopelícula parezcan imitar a las bacterias en la fase de retraso y exhiban una regulación positiva o negativa significativa de numerosos genes perfilados puede explicarse por el hecho de que las bacterias residentes dentro de una biopelícula a menudo están metabólicamente inactivas8. Como tal, cuando se liberan rápidamente de la residencia de la biopelícula por la acción del anti-DNABII, postulamos que las bacterias se liberan en un estado en el que están transitoriamente mal equipadas para mediar las funciones letales de los antibióticos y los PMN humanos. Si bien estas funciones defensivas finalmente se recuperan, el fenotipo NRel brinda una ventana de oportunidad para una erradicación más efectiva de las bacterias que anteriormente residen en biopelículas.

Mientras que hasta ahora se ha informado que una mayor susceptibilidad a los antibióticos es una característica del fenotipo recientemente liberado para múltiples bacterias23,30,31,34,35,36, también estábamos interesados ​​en explorar si también podría haber evidencia de una mayor susceptibilidad a los efectores inmunes. Hasta la fecha, estábamos interesados ​​específicamente en la susceptibilidad a los efectores inmunes innatos, y en tres modelos preclínicos separados de enfermedades humanas, hemos demostrado que cuando se liberan recientemente de una biopelícula por la acción de un anticuerpo dirigido por DNABII, las bacterias y cualquier biopelícula los restos son rápidamente eliminados por el huésped respectivo en ausencia de cualquier antibiótico añadido. Informamos esto para biopelículas mucosas formadas en el oído medio por NTHI en un modelo de chinchilla de otitis media experimental, para biopelículas agregadas formadas en el pulmón murino por Pseudomonas aeruginosa y para biopelículas formadas en la cavidad oral por Aggregatibacter actinomycetemcomitans en un modelo de periimplantitis en ratas24. ,25,26,27. Esta eliminación bacteriana eficiente sin antibióticos y la rápida resolución de la enfermedad nos sugirieron que probablemente estuvieran involucrados efectores inmunes innatos, particularmente PMN. Nuestro interés se despertó aún más cuando mostramos que α-DNABII NTHI NRel demostró una marcada regulación negativa transitoria de dos enzimas (una catalasa y una peroxiredoxina-glutaredoxina) importantes para la mitigación del estrés oxidativo66,67,68,69.

Como tal, evaluamos la muerte relativa de α-DNABII NTHI NRel por parte de PMN humanos dado su papel como primera línea de defensa contra patógenos no deseados. Los PMN atraídos al sitio de la infección exhiben actividades antimicrobianas de diversas maneras. El principal de su arsenal es la destrucción extracelular mediante NETosis, así como la destrucción intracelular mediante especies reactivas de oxígeno después de la fagocitosis70,71. Descubrimos que los NTHI recién liberados de la residencia de la biopelícula por α-DNABII eran de hecho transitorios, pero altamente vulnerables a la muerte por PMN humanos activados. Si bien esta muerte probablemente se debió en general a medios tanto extra como intracelulares, hubo una reducción significativa en la muerte cuando los PMN se trataron previamente con el inhibidor intracelular específico de la NADPH-oxidasa, DPI51. Este hallazgo se alineó bien con la expresión reducida marcada, igualmente transitoria, de hktE y pdgX por parte de la población NRel. El uso de DPI también nos permitió imitar la funcionalidad limitada de los PMN recuperados de individuos con enfermedad granulomatosa crónica que también exhiben una mayor vulnerabilidad a infecciones fúngicas y bacterianas, incluidas aquellas inducidas por patógenos capaces de formar biopelículas altamente recalcitrantes51,72. Finalmente, vale la pena señalar que no hubo diferencia en la mayor susceptibilidad a la muerte por PMN si los NTHI se liberaron de la residencia de la biopelícula por la acción del monoclonal α-DNABII murino o humanizado. Así, estos datos se suman a otros que muestran que el proceso de humanización no disminuyó la actividad de este anticuerpo monoclonal de ninguna manera probado hasta la fecha27,35.

Para determinar si los atributos específicos de NRel eran quizás más ampliamente demostrables en bacterias distintas de NTHI, también exploramos la característica del aumento de la permeabilidad de la membrana externa para tres patógenos humanos adicionales liberados de la residencia de biopelículas por la acción del monoclonal humanizado dirigido contra una proteína DNABII. De hecho, esta característica particular fue compartida por α-DNABII NRel de dos patógenos Gram negativos adicionales, E. coli y P. aeruginosa, así como por un aislado del patógeno Gram positivo S. aureus resistente a meticilina, lo que sugirió que El aumento de la permeabilidad de la membrana externa podría ser una característica común del fenotipo α-DNABII NRel. Una posible limitación de este estudio es que no podemos garantizar que α-DNABII NRel estuviera compuesto exclusivamente por aquellas bacterias recién liberadas de la residencia de la biopelícula, ya que también pueden haber incluido bacterias que abandonaron la residencia de la biopelícula como parte de la remodelación natural de la biopelícula73. No obstante, esta posibilidad no limitó nuestra capacidad para observar y describir distintos fenotipos de aquellas bacterias recién liberadas de la residencia de biopelículas en comparación con sus contrapartes cultivadas planctónicamente.

En conjunto, los nuevos datos proporcionados aquí respaldan la validación continua de un enfoque terapéutico en el que proponemos administrar el anticuerpo monoclonal humanizado a un individuo con una infección de biopelícula recalcitrante para permitir que el sistema inmunológico innato del huésped erradique de manera efectiva las bacterias recién liberadas de la biopelícula, idealmente en una manera controlada. Hasta la fecha, tres modelos preclínicos distintos de enfermedad respaldan esta estrategia sin antibióticos24,25,26. Sin embargo, si fuera necesario o justificado, y dado que se obtuvo una sensibilidad significativa a los antibióticos en cuestión de minutos, propondríamos un enfoque combinatorio en el que se administre conjuntamente un antibiótico ahora eficaz para promover la destrucción rápida de las bacterias a medida que se liberan de la biopelícula patógena. En un mundo altamente resistente a los antibióticos donde las biopelículas bacterianas son persistentes y recalcitrantes tanto al tratamiento con antibióticos convencionales como a la eliminación inmune del huésped, este enfoque anti-DNABII independiente del patógeno puede proporcionar una estrategia novedosa poderosa y ampliamente efectiva que ofrece un potencial terapéutico prometedor en ausencia de nuevos desarrollo de antibióticos para la erradicación de enfermedades relacionadas con biopelículas.

Las donaciones de sangre humana no identificadas proporcionadas por sujetos adultos sanos que abarcan el espectro demográfico del centro de Ohio se realizaron bajo los auspicios del Instituto de Investigación de Servicios de Donantes de Sangre del Hospital Nacional de Niños después de que se obtuvo el consentimiento informado por escrito. Los PMN se aislaron de estas muestras de sangre para su uso en estudios realizados en nuestro laboratorio de conformidad con el protocolo #IBS-00000449 del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) del Nationwide Children's Hospital y según lo aprobado. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes del Comité Institucional de Bioseguridad y Servicios de Donantes de Sangre del Instituto de Investigación del Hospital Nacional de Niños.

La cepa no tipificable de Haemophilus influenzae (NTHI) 86-028NP37,38 se mantuvo congelada en LN2 en el pase n.° 4 en medio artificial desde su aislamiento original de la nasofaringe de un niño al que se le insertó un tubo de timpanostomía debido a otitis media crónica. NTHI 86-028NP se cultivó en caldo de infusión de cerebro y corazón suplementado (sBHI) con hemina (2 µg/ml) (Sigma-Aldrich, n.º de cat. H9039) y β-NAD (2 µg/mL) (Sigma-Aldrich, n.º de cat. . N1511) a 37 °C con 5% de CO2 en atmósfera humidificada. Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) (aislado clínico de un niño con fibrosis quística) o Pseudomonas aeruginosa cepa 142-135 (Universidad del Norte de Texas) se cultivaron en agar Tryptic Soy (TSA) o en caldo Tryptic Soy. La cepa de Escherichia coli UTI8922 se cultivó en agar caldo de lisogenia o en caldo de lisogenia (LB) durante 18 a 24 h a 37 °C, 5% de CO2 en una atmósfera humidificada.

Un anticuerpo monoclonal murino (Rockland Immunochemicals, Inc., Philadelphia, PA)24 o humanizado (Lake Pharma, Inc., San Carlos, CA)35,50 del isotipo IgG contra un péptido quimérico de punta diseñado para imitar epítopos protectores del Las "puntas" de unión al ADN de las subunidades alfa y beta de una proteína bacteriana DNABII se prepararon para nosotros bajo contrato con Rockland Immunochemicals, Inc. o Lake Pharma, Inc., respectivamente. Estos anticuerpos monoclonales se denominan MsTipMab (murino) o HuTipMab (humanizado).

Se sembraron dos ml y medio de NTHI, E. coli UTI89, P. aeruginosa 142-1 o MRSA a 2 x 105 UFC/ml en tubos de cultivo de tejido planos de 10 cm2 separados (TPP, Trasadingen, Suiza, n.º de catálogo 91243) y se dejó establecer cuando se incubó estáticamente a 37 °C con 5% de CO2 en una atmósfera humidificada en el medio respectivo durante 16 h. Después de 16 h, los tubos se invirtieron cuidadosamente en la incubadora. Se vertió el medio que contenía bacterias no adherentes. Mientras estaba invertido, se agregaron 2,5 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco equilibrada (37 °C, 5 % CO2) sin calcio ni magnesio (DPBS). Los tubos se rotaron 360° para eliminar suavemente las bacterias no adherentes adicionales y el DPBS se vertió como se indicó anteriormente. Para generar α-DNABII NTHI NRel, se incubaron biopelículas lavadas a 37 °C con 5% de CO2 en una atmósfera humidificada durante 1 m, 5 m, 15 m, 2 h, 4 h o 6 h con MsTipMab o HuTipMab a una concentración de 5 µg de anticuerpo diluido en sBHI/0,8 cm2. El número de NTHI liberados de la residencia de la biopelícula por α-DNABII o aquellos que crecen en los fluidos sobre la biopelícula en un momento determinado se proporciona en la Tabla complementaria S1. Para producir α-DNABII E. coli UTI89, P. aeruginosa 142-1 o MRSA NRel, se incubaron biopelículas respectivas de 16 h a 37 °C, 5 % de CO2 en una atmósfera humidificada durante 2 h con HuTipMab a una concentración de 5 µg de anticuerpo. diluido en sBHI/0,8 cm2.

Para determinar la cinética de la sensibilidad relativa del α-DNABII NTHI NRel a la muerte mediada por antibióticos, incubamos el NRel con amoxicilina (Sigma-Aldrich, Cat no. 31586) y clavulanato de litio (Sigma-Aldrich, Cat no. 1134426). ) (A/C) o con trimetoprima (Sigma-Aldrich, Cat no. T7883) y sulfametoxazol (Sigma-Aldrich, Cat no. 723-46-6) (T/S) como se describió anteriormente, con modificaciones36. Como se indicó anteriormente, se establecieron, lavaron y trataron biopelículas de NTHI de 16 h en tubos de cultivo de tejidos durante 1 m, 5 m, 15 m, 2 h, 4 h o 6 h para producir α-DNABII NTHI NRel de diferentes 'edades'. Luego se vertieron cuidadosamente α-DNABII NTHI NRel en tubos Eppendorf y se sonicaron durante 2 m en un sonicador de baño de agua para dispersar los agregados bacterianos. Se agregaron alícuotas de 90 µl de las suspensiones bacterianas a una placa de 96 pocillos, seguido de 10 µl de A/C o T/S. Predeterminamos la concentración de antibiótico que mantendría la destrucción de NTHI que reside en los fluidos que recubren una biopelícula en nuestro sistema de cultivo entre ~ 15 y 25% para permitirnos detectar y cuantificar fácilmente cualquier destrucción mejorada de α-DNABII NTHI NRel36 . Las concentraciones de antibióticos utilizados en cada momento se enumeran en la Tabla 1. Como control negativo, se agregaron simultáneamente 10 µl del diluyente antibiótico solo a los pocillos respectivos separados en la placa de ensayo de 96 pocillos. Las bacterias y los antibióticos se incubaron estáticamente durante 2 h a 37 °C, 5% de CO2 en una atmósfera humidificada. Después de 2 h, la placa de 96 pocillos se sonicó durante 2 m en un sonicador de baño de agua para romper los agregados bacterianos. Luego, cada pocillo se diluyó en serie y se sembró en placas sobre agar chocolate para determinar las unidades formadoras de colonias (UFC)/ml. El porcentaje de supervivencia se calculó comparando UFC/ml del diluyente solo ("sin antibióticos") con las bacterias tratadas con antibióticos. Las UFC/ml de los pocillos de antibióticos se dividieron por las UFC/ml de los pocillos de solo diluyente, se multiplicaron por 100 y luego este valor se restó de 100 para calcular el porcentaje de muerte. Los experimentos se realizaron con 2 a 3 triplicados técnicos por ensayo y un mínimo de tres veces en días separados.

El aislamiento de ARN y la qRT-PCR se realizaron como se describió anteriormente36 con algunas modificaciones. Brevemente, para preparar el aislamiento de ARN, se sembraron tubos de cultivo de tejido planos de 10 cm2 con 2,5 ml de NTHI a 2 x 105 UFC/ml. Después de 16 h de incubación a 37 °C, 5% de CO2 y atmósfera humidificada, los tubos se lavaron suavemente como se describe en detalle anteriormente. Los tubos de cultivo de tejidos se trataron con 5 µg de MsTipMab por 0,8 cm2. Los tubos se devolvieron a la incubadora, se invirtieron suavemente para que el medio cubriera la biopelícula y se dejaron incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 2 h o 6 h. Después de 2 h o 6 h, se invirtieron los tubos y se recogió el α-DNABII NTHI NRel ("2 h NRel" o "6 h NRel", respectivamente) vertiéndolo en tubos Eppendorf separados. Se centrifugaron α-DNABII NTHI NRel durante 1 ma 16.000 x ga 4 °C, se aspiró el sobrenadante y luego se añadió 1 ml de reactivo TRIzol (Thermo Fisher Scientific, n.º de catálogo 15-596-026) a los sedimentos bacterianos. Las soluciones bacterianas suspendidas se transfirieron a tubos Phasemaker separados (Thermo Fisher Scientific, nº de catálogo A33248), se recogió el ARN siguiendo las instrucciones del fabricante y se purificó el ARN utilizando un kit Qiagen RNeasy (Qiagen, nº de catálogo 74106). El ADN residual se eliminó mediante tratamiento con DNasa I (NEB, n.º de cat. M0303L) y SUPERase In RNase Inhibitor (Ambion, n.º de cat. AM2694) según las instrucciones del fabricante durante 45 m a 37 °C. Se repitió el tratamiento con ADNasa I. La qRT-PCR se realizó con el kit SuperScript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR (Invitrogen, n.º de catálogo 11736059) y los cambios en la expresión génica se calcularon mediante el método ΔΔCt. Los cebadores utilizados para qRT-PCR se enumeran en la Tabla complementaria 1. Los experimentos se realizaron un mínimo de tres veces con 2 a 3 réplicas técnicas por ensayo y en días separados.

Los neutrófilos humanos se aislaron de la sangre mediante selección magnética negativa utilizando el kit de aislamiento de neutrófilos humanos EasySep (StemCell Technologies, Inc., n.º de catálogo 17957). La susceptibilidad del NTHI a la destrucción por neutrófilos humanos se evaluó como se describió anteriormente74, con algunas modificaciones. Se sembraron 1 x 106 neutrófilos en 1 ml de DPBS en una placa de 24 pocillos sin tratamiento con cultivo de tejidos. Los neutrófilos se activaron mediante la adición de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) 50 nM (Sigma-Aldrich, número de catálogo P8139) durante 10 m a 37 °C, 5% de CO2 en una atmósfera humidificada. Los NRel se recogieron de tubos de cultivo de tejidos después de 2 h o 6 h, como se describió anteriormente. Todas las suspensiones bacterianas se sonicaron durante 2 m en un sonicador de baño de agua para romper los agregados, luego se diluyeron de modo que se agregara un rango de 4,0 × 103–2,5 × 105 UFC NTHI/1 ml de DPBS por pocillo en la placa de ensayo de 24 pocillos. . Para los experimentos que utilizaron el inhibidor de la NADPH-oxidasa intracelular, cloruro de difenilenoyodonio (DPI) (Sigma-Aldrich, n.º de catálogo D2926), se añadió DPI 0,05 µM a los neutrófilos no activados, se dejó incubar durante 30 s a temperatura ambiente y luego 50 Se añadió PMA nM para activar los neutrófilos, como se indicó anteriormente51,74. Independientemente de si los neutrófilos fueron o no pretratados con DPI, planctónico o α-DNABII NTHI NRel y los neutrófilos activados se incubaron durante 30 m a 37 ° C, 5% de CO2 en una atmósfera humidificada. Después de 30 minutos, se agregaron a cada pocillo 100 µl de 10 × TrypLE (Thermo Fisher Scientific, n.º de catálogo A1217701), se pipetearon vigorosamente, se diluyeron y se sembraron en agar chocolate para su enumeración. Los experimentos se realizaron con 2 a 3 triplicados técnicos por ensayo en días individuales durante un mínimo de seis días separados.

Se evaluaron las permeabilidades relativas de la membrana cultivadas planctónicamente y α-DNABII NTHI, E. coli UTI89, P. aeruginosa 142-1 o MRSA NRel mediante el uso del colorante intercalante fluorescente SYTOX Green Nucleic Acid Stain (Invitrogen, Cat no. S7020)75 ,76. Las bacterias cultivadas planctónicamente en fase logarítmica media se prepararon de la siguiente manera. NTHI de una placa de agar chocolate, E. coli UTI89 de una placa de agar LB, o colonias de P. aeruginosa 142-1 o MRSA de una placa TSA se suspendieron por separado en 1,5 ml del medio respectivo equilibrado a OD490 0,10, luego se dejaron crecer estáticamente durante 3 h (para NTHI o MRSA) o 2,5 h (para E. coli UTI89 o P. aeruginosa 142-1) con una tapa ventilada a 37 °C con 5 % de CO2. Después de la incubación, se leyó la DO490 del cultivo cultivado planctónicamente. Todas las suspensiones bacterianas se centrifugaron a 14.000 rpm durante 3 min a 4 °C. Luego se resuspendieron las bacterias cultivadas planctónicamente en 900 µl de DPBS. Se resuspendieron α-DNABII NTHI, E. coli UTI89, P. aeruginosa 142-1 o MRSA NRel en 1,2 ml de DPBS y se centrifugaron como antes. Este proceso se repitió hasta dos veces más para α-DNABII NRel para eliminar cualquier fluorescencia de fondo.

Durante 2 h α-DNABII NTHI, E. coli UTI89, P. aeruginosa 142-1 o MRSA NRel, se resuspendieron bacterias en un volumen final de 900 µl de DPBS. Se resuspendieron 6 h de α-DNABII NTHI NRel en un volumen final de 500 µl de DPBS. Se resuspendieron 6 h de NRel en un volumen menor de DPBS dado que las UFC/mL de bacterias recolectadas después de 6 h de exposición de la biopelícula a α-DNABII fue menor que a las 2 h. Todas las suspensiones bacterianas se sonicaron suavemente durante 2 m en un sonicador de baño de agua para romper los agregados bacterianos. Se agregaron alícuotas de 100 µl de cada suspensión bacteriana a sus respectivos pocillos en una placa negra de 96 pocillos MaxiSorp FluoroNunc (Thermo Fisher Scientific, n.º de catálogo 437111) junto con SYTOX Green 0,5 µM o Triton X-100 al 0,5 % (Sigma-Aldrich, N.º de catálogo T8787) más SYTOX Green 0,5 µM para NTHI y MRSA y SYTOX Green 5 µM o SYTOX Green 5 µM más Triton X-100 al 0,5 % (concentraciones finales) para E. coli UTI89 y P. aeruginosa 142-1. Fue necesario el uso de una mayor concentración de SYTOX Green con E. coli UTI89 y P. aeruginosa 142-1 ya que los tamaños de genoma más grandes (en comparación con MRSA o NTHI) requieren una mayor concentración de SYTOX Green para maximizar la intercalación en todo el genoma más grande y conservar la linealidad. rango de fluorescencia77,78. Cada suspensión bacteriana se añadió a los pocillos respectivos de modo que se lograra un rango de 2 a 4 × 107 UFC para todos los patógenos respectivos/pocillo. Los experimentos se realizaron un mínimo de tres veces en días separados con tres triplicados técnicos por ensayo. La fluorescencia se midió espectrofotométricamente (a una longitud de onda de excitación de 480 nm y una longitud de onda de emisión de 522 nm) cada 15 m durante 120 m a 37 °C mediante un lector de microplacas FLUOstar Omega (BMG LABTECH, Ortenberg, Alemania).

La significación estadística se determinó con GraphPad Prism Versión 9 mediante la prueba t de dos colas no pareada de Student para la comparación de medias entre dos grupos, ANOVA de dos vías con corrección de Šidák o análisis de efectos mixtos para la comparación de más de dos grupos, o medidas repetidas lineales. modelo mixto para comparar datos de evolución temporal. La descripción del análisis estadístico utilizado se puede encontrar en las leyendas de las figuras. Todos los ensayos in vitro se repitieron un mínimo de tres veces en días separados. Un valor de p ≤ 0,05 se indica con *, un valor de p ≤ 0,01 se indica con **, un valor de p ≤ 0,001 se indica con *** y un valor de p ≤ 0,0001 se indica con ** **.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados para el estudio actual estarán disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Agradecemos a Jennifer Neelans por su ayuda con la preparación del manuscrito. Agradecemos a Christian Ahearn, PhD, por sus reflexivas discusiones y su ayuda con la metodología del ensayo de permeabilidad de membrana. También agradecemos al Biostatistics Resource del Nationwide Children's Hospital (BRANCH) y al Centro de Bioestadística de la Universidad Estatal de Ohio por su ayuda con el diseño de ensayos y la realización de análisis estadísticos apropiados. Finalmente, agradecemos a aquellas personas que donaron sangre a través del Servicio de Donación de Sangre del Instituto de Investigación Abigail Wexner del Nationwide Children's Hospital.

Este trabajo fue financiado por los NIH (R01DC011818 para LOB y SDG y R01DC003915 para LOB). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Centro de Patogénesis Microbiana, Instituto de Investigación Abigail Wexner del Nationwide Children's Hospital, Columbus, OH, 43205, EE. UU.

Kathryn Q. Wilbanks, Elaine M. Mokrzan, Theresa M. Kesler, Nikola Kurbatfinski, Steven D. Goodman y Lauren O. Bakaletz

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina de la Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, 43205, EE. UU.

Steven D. Goodman y Lauren O. Bakaletz

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Conceptualización: EMM, ODS, LOB; Curación de datos: KQW, EMM, TMK, NK; Análisis formal: KQW, EMM, TMK, NK; Adquisición de financiación: ODS, LOB; Investigación: KQW, EMM, TMK, NK; Metodología: KQW, EMM, TMK, NK, SDG, LOB; Administración de proyectos: ODS, LOB; Recursos: ODS, LOB; Supervisión: ODS, LOB; Validación: KQW, EMM, TMK, NK, SDG, LOB; Visualización: KQW, EMM, TMK, NK, SDG, LOB; Escritura: preparación del borrador original: KQW, LOB; Redacción: revisión y edición: KQW, EMM, TM.K., NK, SDG, LOB

Correspondencia a Lauren O. Bakaletz.

LOB y SDG son inventores de tecnología y poseen patentes relacionadas con el enfoque dirigido por DNABII, cuyos derechos han sido otorgados bajo licencia a Clarametyx Biosciences, Inc. LOB y SDG son fundadores científicos y copresidentes del consejo asesor científico de Clarametyx Biosciences, Inc. KQW , EMM, TMK y NK no declaran tener intereses en competencia.

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Wilbanks, KQ, Mokrzan, EM, Kesler, TM et al. El Haemophilus influenzae no tipificable liberado de la residencia en una biopelícula por un anticuerpo monoclonal dirigido contra un componente de la matriz de la biopelícula muestra un fenotipo vulnerable. Informe científico 13, 12959 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40284-5

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Recibido: 14 de abril de 2023

Aceptado: 07 de agosto de 2023

Publicado: 10 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40284-5

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