Un papel fundamental de una microbiota eubiótica para activar la inmunocompetencia adecuada en Arabidopsis

Naturaleza Plantas (2023)Citar este artículo

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Aunque muchos estudios han demostrado que los microbios pueden estimular o suprimir ectópicamente las respuestas inmunes de las plantas, la pregunta fundamental de si toda la microbiota preexistente es realmente necesaria para el desarrollo adecuado de la respuesta inmune de las plantas sigue sin respuesta. Utilizando un sistema de crecimiento de plantas gnotobiótico a base de turba desarrollado recientemente, descubrimos que Arabidopsis cultivada en ausencia de una microbiota natural carecía de maduración dependiente de la edad de la respuesta inmune de la planta y era defectuosa en varios aspectos de la inmunidad desencadenada por patrones. Las plantas axénicas mostraron hipersusceptibilidad a la infección por la bacteria patógena Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 y el hongo patógeno Botrytis cinerea. La inmunocompetencia mediada por la microbiota fue suprimida por condiciones ricas en nutrientes, lo que indica una interacción tripartita entre el huésped, la microbiota y el entorno abiótico. Una microbiota sintética compuesta por 48 cepas bacterianas cultivables de la endosfera foliar de plantas sanas de Arabidopsis pudo restaurar sustancialmente una inmunocompetencia similar a la de las plantas inoculadas con una comunidad derivada del suelo. Por el contrario, una microbiota foliar sintética disbiótica de 52 miembros sobreestimuló el transcriptoma inmunológico. En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de un papel causal de la microbiota eubiótica en la activación de la inmunocompetencia adecuada y la inmunidad dependiente de la edad en las plantas.

Las partes aéreas y subterráneas de las plantas terrestres albergan una variedad de microorganismos, que colectivamente constituyen la microbiota vegetal. Los miembros de la microbiota pueden residir sobre o dentro de las plantas y parecen estar taxonómicamente conservados a nivel de filo1,2,3,4,5,6,7,8. La amplia conservación de la microbiota vegetal sugiere que las plantas probablemente hayan desarrollado mecanismos para seleccionar y mantener la abundancia, composición y función de la microbiota para lograr la homeostasis9. Una microbiota correctamente ensamblada (es decir, microbiota eubiótica) es probablemente esencial para la salud y la supervivencia de las plantas, ya que estudios recientes han comenzado a revelar efectos nocivos de las microbiotas disbióticas inducidas genéticamente en la salud de las plantas10,11,12,13. Aunque se ha demostrado que miembros individuales o grupos de la microbiota mejoran la absorción de nutrientes, el crecimiento y la resistencia al estrés abiótico y biótico1,2,14,15,16, no se comprende bien la contribución de toda la microbiota autóctona de una planta a las funciones de la planta. Esto se debe en gran medida a interacciones microbio-microbio y microbio-planta mal analizadas a nivel comunitario.

Diferentes miembros de la microbiota vegetal pueden formar interacciones mutualistas, comensales o patógenas con las plantas. Para protegerse contra explotaciones potencialmente dañinas por parte de microorganismos, las plantas han desarrollado receptores inmunes intracelulares y de superficie celular que reconocen patrones moleculares asociados a microbios (PAMP) o proteínas efectoras derivadas de patógenos conservados evolutivamente, lo que resulta en inmunidad activada por patrones (PTI) o inmunidad activada por efectores. inmunidad (ETI), respectivamente. Si bien la ETI parece ser específica para los patógenos, la PTI representa una línea basal de defensa de la planta contra microbios patógenos y no patógenos y es necesaria para mantener una microbiota de la filosfera eubiótica en Arabidopsis para prevenir la disbiosis10,11. La señalización de PTI se inicia tras la percepción de PAMP por parte de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) localizados en la membrana plasmática17. Por ejemplo, un epítopo de 22 aminoácidos derivado de la flagelina bacteriana (flg22) es un inductor bien caracterizado de PTI y es reconocido por el PRR FLAGELLIN-SENSITIVE 2 (FLS2) (ref. 18). FLS2 forma un complejo con el correceptor QUINASA 1 ASOCIADO AL RECEPTOR 1 INSENSIBLE A BRASSINOSTEROIDES (BAK1) (ref. 19). Los fósforos entre FLS2, BAK1, la QUINASA 1 INDUCIDA POR BOTRITIS (BIK1) y una cascada MAPK inician eventos de señalización de PTI posteriores, incluida la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), flujos de calcio, expresión de un gran conjunto de genes relacionados con la defensa, remodelación de la pared y cierre de estomas20,21,22,23,24,25. La activación de PTI antes de una infección también puede dar lugar a una mayor resistencia a los patógenos26,27.

La resistencia relacionada con la edad (ARR) es un fenómeno ampliamente observado en plantas en las que las plantas jóvenes exhiben una mayor susceptibilidad a las enfermedades en comparación con las plantas más viejas28,29. Esto se observa en muchas plantas con flores frente a una variedad de patógenos30. En Arabidopsis, por ejemplo, la susceptibilidad basal de las plantas jóvenes al patógeno bacteriano foliar Pseudomonas syringae pv. tomate (Pst) DC3000 es mayor en comparación con las plantas más viejas31. Una hipótesis para explicar la ARR implica el concepto de compensación entre crecimiento y defensa: para equilibrar las asignaciones de recursos durante el crecimiento vegetativo vigoroso en las primeras etapas de la vida, las plantas jóvenes priorizan el crecimiento sobre la defensa32,33. De hecho, existe evidencia de conexiones moleculares directas entre el crecimiento de las plantas y la inmunidad34,35,36, incluidos componentes comunes de señalización de doble función, como en el caso del PTI y el crecimiento de las plantas dependiente de brasinoesteroides37. Sin embargo, no está claro si conexiones moleculares como estas son la única base para la ARR en las plantas. En el reino animal, el desarrollo de animales gnotobióticos, como los ratones libres de gérmenes, llevó a los investigadores a descubrir una importante contribución de la microbiota endógena en la maduración posnatal de las respuestas inmunes innatas en animales recién nacidos38,39. Esto plantea la posibilidad de que la microbiota vegetal también contribuya a la maduración de la inmunidad vegetal. Sin embargo, sigue siendo una cuestión abierta si la inmunidad dependiente de la edad es completamente intrínseca al desarrollo de las plantas o si la maduración de PTI es, en parte, el resultado de la colonización de una microbiota. Además, en los animales, la presencia de comunidades microbianas disbióticas puede estar relacionada con respuestas inmunes exageradas, que tienen consecuencias clínicas debilitantes40. Recientemente se han descrito en plantas comunidades microbianas disbióticas genéticamente inducidas y de origen natural10,41,42, pero no está claro si la microbiota disbiótica en las plantas está asociada con respuestas inmunitarias hiperactivas. Abordar estas preguntas básicas sobre el microbioma requiere el desarrollo de sistemas de crecimiento de plantas gnotobióticos adecuados y el establecimiento de comunidades microbianas normales (eubióticas) y disbióticas bien caracterizadas.

En un estudio reciente, informamos sobre dos sistemas de crecimiento de plantas gnotobióticos basados ​​en turba, FlowPot y GnotoPot43, y dos comunidades bacterianas sintéticas, una comunidad eubiótica de hojas sanas de Arabidopsis y una comunidad disbiótica de hojas de Arabidopsis min7 fls2 efr cerk1 (mfec) cuádruple mutante, que carece de la capacidad de mantener una comunidad bacteriana endofítica eubiótica10. Aquí empleamos estas herramientas para abordar las preguntas sobre el papel del microbioma endógeno en el desarrollo de ARR y un posible papel de la eubiosis en la activación de la inmunidad basal adecuada de la planta.

Comenzamos este proyecto caracterizando la posible maduración de PTI a lo largo del tiempo en plantas de Arabidopsis cultivadas convencionalmente. Para este propósito, realizamos los ensayos clásicos de protección de flg22 utilizando plantas de Arabidopsis de 2,5 semanas y 3,5 semanas de edad, que se cultivaron convencionalmente en un sustrato de tierra para macetas en cámaras de crecimiento con circulación de aire. En plantas de 2,5 semanas de edad, observamos un nivel modesto de resistencia mediada por flg22 al virulento Pst DC3000 en plantas tratadas con flg22 en comparación con plantas tratadas de forma simulada. Sin embargo, las plantas más viejas, de 3,5 semanas de edad, exhibieron un nivel significativamente mayor de resistencia activada por flg22 en comparación con las plantas de 2,5 semanas de edad (Fig. 1a). Este resultado demostró el desarrollo de PTI dependiente de la edad en plantas de Arabidopsis cultivadas en el suelo, lo que es consistente con un estudio reciente que muestra que la inmunidad dependiente de FLS2 aumentó en los primeros 6 días de crecimiento de plántulas jóvenes en medio agar sin microbios44.

a, ensayo de protección de flg22 que muestra una resistencia mejorada contra Pst DC3000 provocada por el tratamiento previo con flg22 500 nM en plantas de 2,5 y 3,5 semanas de edad. Cada barra representa el título bacteriano medio (± sd) 24 h después de la inoculación como ufc cm-2 transformadas logarítmicamente (n = 6 plantas). Letras diferentes encima de las barras representan una diferencia significativa (P <0,05, análisis de varianza bidireccional (ANOVA) con prueba post-hoc de diferencia significativa honesta (HSD) de Tukey). b, Protección flg22 dependiente de la edad. Las plantas AX o HO se trataron 24 h antes de la inoculación con Pst DC3000 con agua (simulada) o con una solución de flg22 100 nM. Cada barra representa el título bacteriano medio (± sd) 24 h después de la inoculación como ufc cm-2 transformadas logarítmicamente (n = 3 plantas). Letras diferentes representan una diferencia significativa (P <0,05, ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc HSD de Tukey). c, La protección relativa se muestra como un cambio en los recuentos de células bacterianas entre las muestras tratadas con flg22 y simuladas. Derivado de recuentos absolutos cuantificados en b. Las barras de error representan sd. Letras diferentes representan una diferencia significativa (P < 0,05, ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc HSD de Tukey). d, e, expresión del gen FRK1 dependiente de la edad inducida por basal (d) y flg22 (e) en plantas AX y HO de 3,5 semanas y 5,5 semanas de edad. El ARN total se extrajo 4 h después del tratamiento con una solución simulada que carecía de flg22 para la expresión basal o flg22 100 nM para la expresión inducida por flg22. Los niveles de expresión se muestran en relación con plantas HO de 3,5 semanas de edad tratadas de forma simulada para ambos paneles. Se utilizó PP2AA3 para la normalización. Los resultados representan la media ± sd (n = 4 plantas). Letras diferentes representan una diferencia significativa (P <0,05, ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc HSD de Tukey). a – e, Los experimentos se repitieron tres veces independientes con resultados similares. Los valores P exactos para todas las comparaciones se detallan en los datos de origen.

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Tradicionalmente, la resistencia relacionada con la edad se ha atribuido a procesos de transición del desarrollo45. Examinamos una hipótesis adicional de que el microbioma endógeno podría estar involucrado en la PTI dependiente de la edad en las plantas. Para este propósito, investigamos la maduración temporal de la resistencia mediada por flg22 en sistemas de crecimiento de plantas gnotobióticos basados ​​en turba. Plantas holoxénicas (HO) colonizadas con una comunidad microbiana natural derivada del suelo ('MSU', recolectada de suelo agrícola ubicado en la Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, Michigan; ver Métodos) y plantas axénicas (AX) correspondientes, que fueron inoculadas de forma simulada. con 'comunidad microbiana derivada del mismo suelo' MSU esterilizada en autoclave. Como se muestra en la Fig. 1b, c, las plantas HO exhibieron una resistencia mediada por flg22 progresivamente más robusta contra Pst DC3000 con el tiempo, lo que es consistente con la PTI dependiente de la edad observada en plantas cultivadas convencionalmente en tierra para macetas (Fig. 1a). Por el contrario, las plantas AX inoculadas simuladamente con la comunidad microbiana esterilizada en autoclave se redujeron considerablemente en el fenotipo de resistencia mediado por flg22 dependiente de la edad (Fig. 1b, c). El mutante de Arabidopsis bak1-5 bkk1-1 cerk1 (bbc) (ref.46), que es defectuoso en la señalización de PTI aguas abajo de múltiples PRR, incluido el receptor flg22 FLS2, no mostró resistencia mediada por flg22 en plantas HO a ninguna edad (Extended Datos Fig. 1), lo que sugiere que la resistencia dependiente de la edad mediada por la microbiota requiere correceptores de señalización PTI canónicos.

A continuación, cuantificamos la inducción del gen marcador PTI QUINASA 1 TIPO RECEPTOR INDUCIDA POR FLG22 (FRK1) para caracterizar aún más la activación de PTI dependiente de la edad en plantas HO y la aparente falta de la misma en plantas AX. Si bien la expresión basal de FRK1 fue similar para plantas HO de 3,5 y 5,5 semanas de edad (Fig. 1d), flg22 indujo un nivel más alto de expresión de FRK1 en plantas HO viejas que en plantas HO más jóvenes (Fig. 1e). Curiosamente, la expresión basal de FRK1 fue menor en las plantas AX en comparación con las plantas HO jóvenes o viejas (Fig. 1d) y, en particular, no se observó un aumento significativo dependiente de la edad en la expresión de FRK1 inducida por flg22 en las plantas AX (Fig. 1e). . Por lo tanto, la maduración reducida de PTI dependiente de la edad en AX se correlaciona con una falta de aumento robusto en la expresión del gen FRK1 dependiente de la edad.

Para capturar la expresión genética de todo el genoma en plantas AX y HO más allá del gen marcador FRK1, realizamos un análisis del transcriptoma de plantas AX y HO Arabidopsis cultivadas en el sistema gnotobiótico de turba. Para reducir la posibilidad de un sesgo específico de la comunidad debido al uso de una sola microbiota, se utilizaron comunidades microbianas recolectadas de dos suelos distintos: 'MSU', que se recolectó como tipo de suelo Alfisol, y 'Malaka', que se recolectó de suelos no perturbados. suelo de pastizal en Malaka Township, Iowa (ver Métodos) y es un suelo Mollisol. El análisis de componentes principales (PCA) de los datos de expresión del gen RNA-seq reveló patrones de expresión distintos entre las plantas HO y las plantas AX (PC1, 26% de variación; Fig. 2a). Usando |log2FC| ≥ 1 y tasa de descubrimiento falso (FDR) <0,05 de corte, identificamos un total de 435 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) entre plantas HO y AX en ambas entradas de microbiota: 352 se agotaron en plantas AX y 83 se enriquecieron en plantas AX. (Fig. 2b, cy Datos complementarios 1). De los 352 DEG agotados en plantas AX, 138 se agotaron independientemente de la fuente de entrada de la microbiota (es decir, enriquecidos tanto en plantas HO colonizadas por la comunidad 'MSU' como en plantas HO colonizadas por la comunidad 'Malaka'; Fig. 2d). El análisis de enriquecimiento de términos de ontología genética (GO) de estos 138 genes "centrales" agotados en AX reveló una sobrerrepresentación de los términos involucrados en la inmunidad de las plantas (Fig. 2e y Datos complementarios 2). Los genes enriquecidos en plantas AX no mostraron ningún enriquecimiento significativo en el término GO. Un examen más detenido de los DEG empobrecidos en plantas AX reveló numerosos genes involucrados en PTI, la defensa mediada por la hormona de defensa ácido salicílico (SA) y la biosíntesis de metabolitos asociados a la defensa (Fig. 2c y Datos complementarios 1). Estos genes incluían FRK1; varias proteínas quinasas repetidas ricas en leucina tales como SUSCEPTIBILIDAD 1 DETERMINADA PARA OOMYCETE (IOS1), AT1G51890, AT1G51790, AT1G51860 y AT5G59680; genes asociados a la inmunidad sistémica INDUCIDO POR ÁCIDO AZELAICO 1 (AZI1) y AZI3; PATOGENIA RELACIONADA 2 (PR2) y PR4; genes de biosíntesis de glucosinolatos tales como OXIDOREDUCTASA ENLACE A FAD (FOX1) y las monooxigenasas del citocromo P450 CYP71A12 y CYP71B15; y factores de transcripción asociados a la defensa MYB15 y WRKY 30 (Fig. 2c y Datos complementarios 1). Por lo tanto, de acuerdo con el análisis de expresión del gen FRK1 dirigido que se muestra en la Fig. 1d, los resultados del análisis del transcriptoma utilizando dos microbiotas independientes derivadas del suelo apuntaron a una expresión del gen de defensa PTI/SA ampliamente agotada en plantas AX en comparación con plantas HO, que colectivamente contribuyen a la inmunidad innata inducida y basal.

a, análisis PCA de genes expresados ​​en condiciones AX y HO utilizando comunidades microbianas de dos lugares/tipos de suelo diferentes ('MSU': Michigan, tipo de suelo Alfisol; 'Malaka': Iowa, tipo de suelo Mollisol). b, Gráfico de volcán de DEG. Las regiones coloreadas representan una expresión diferencial significativa con |log2FC| > 1 y FDR <0,05 de corte (prueba de Wald corregida por Benjamin-Hochberg) con el número de genes correspondientes a cada grupo indicado entre paréntesis. c, Mapa de calor de DEG generado mediante agrupación jerárquica con distancia euclidiana y vinculación completa. El superíndice de la etiqueta indica la comunidad utilizada para la inoculación de plantas HO o la inoculación simulada de plantas AX. A la derecha se muestra un subconjunto de genes regulados diferencialmente en HO y AX. d, el diagrama de Venn de DEG regulados positivamente mostró 138 genes comunes en respuesta a los tratamientos con HOMSU y HOMalaka. e, análisis de enriquecimiento del término GO (proceso biológico GO:BP) en DEG empobrecidos 'centrales' en plantas AX. Se muestran los términos GO más enriquecidos, clasificados por importancia (límite de FDR < 0,05). a – e, n = 3 muestras de plantas biológicamente independientes por condición.

Además de la expresión de genes inmunes agotada, encontramos que las plantas AX exhibieron niveles significativamente más bajos de otras respuestas inmunes asociadas a PTI en comparación con las plantas HO. Por ejemplo, las plantas AX de 6 semanas de edad exhibieron una producción de ROS inducida por flg22, elf18 y Pep1 significativamente reducida en comparación con las plantas HO, tanto en la magnitud de la producción máxima de ROS (amplitud máxima) como en el tiempo para alcanzar el máximo (Fig. .3a y datos ampliados Fig. 2). Las plantas AX también exhibieron una expresión del gen FRK1 inducida por PAMP / DAMP significativamente reducida en comparación con las plantas HO (Fig. 3b). El análisis de transferencia Western reveló que a pesar de poseer niveles similares de MPK3 y MPK6 total (Fig. 3c, d), se fosforiló menos MPK en plantas AX después de la activación de PTI mediante el tratamiento con flg22 (Fig. 3e). Aunque el análisis de transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR) mostró consistentemente que la expresión tanto basal como inducida por flg22 del gen del receptor FLS2 se reduce significativamente en el tejido de la hoja de la planta AX en comparación con el tejido de la hoja de la planta HO (Fig. 3f), total La abundancia de proteína FLS2 fue variable y solo ocasionalmente se redujo en las hojas de la planta AX (Datos ampliados, Fig. 3). Por el contrario, la proteína correceptora BAK1 se encontró consistentemente en una abundancia relativa menor en las plantas AX en comparación con las plantas HO (Fig. 3g). Además, la cuantificación de la hormona de defensa SA, que se encuentra aguas abajo de la señalización de PTI, reveló que las plantas AX poseen niveles basales más bajos de SA en comparación con las plantas HO (Datos ampliados, Fig. 4a, b). Finalmente, las plantas AX eran hipersensibles a la infección por el virulento patógeno bacteriano hemibiotrófico foliar Pst DC3000 y el patógeno fúngico necrotrófico B. cinerea en comparación con las plantas HO (Fig. 3h, i). En conjunto, estos estudios demuestran múltiples fenotipos inmunes a PTI comprometidos en plantas axénicas.

a, dinámica de explosión de ROS inducida por flg22, elf18 y Pep1 250 nM en plantas AX y HO en GnotoPots. Los resultados representan la media ± sem (n = 8 plantas). b, expresión del gen FRK1 en plantas AX y HO inducida por flg22, elf18 y Pep1 250 nM. El ARN total se extrajo de los discos de las hojas 1,5 h después del tratamiento. Las barras representan la media ± sd (n = 8 plantas; flg22 P = 0,009, elf18 P = 0,017, Pep1 P = 0,034; ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Šidák). c, d, Transferencias representativas de proteínas MPK3 (c) o MPK6 (d) totales en plantas AX y HO de 4,5 semanas de edad. La proteína se detectó con anticuerpos específicos de MPK3 o MPK6. Los números indican la intensidad de la banda en relación con la de Ponceau S, normalizada a HO = 1,00. e, Transferencia representativa de proteínas MPK3/6 fosforiladas detectadas usando un anticuerpo α-p44/42-ERK tras el tratamiento con flg22 100 nM. Las muestras se tomaron en los momentos indicados después del tratamiento. f, Expresión basal y inducida por flg22 del gen FLS2 en tejido de hojas de plantas AX y HO. El ARN total se extrajo 1 h después del tratamiento con flg22 100 nM o una solución simulada. Las barras representan la media ± sd (n = 3 muestras de plantas biológicamente independientes). Letras diferentes representan una diferencia significativa (P <0,05, ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc HSD de Tukey). g, proteína BAK1 total detectada en lisados ​​de hojas de plantas AX y HO. Los números indican la intensidad de la banda en relación con Amido Black, normalizada a HO = 1,00. h, poblaciones de Pst DC3000 en plantas AX y HO. Cada barra representa el título bacteriano medio (± sd) 3 días después de la inoculación como ufc cm-2 transformadas logarítmicamente (n = 3 plantas). P = 0,0006, prueba t no apareada de dos colas. i, Tamaño de las lesiones formadas en plantas AX y HO por B. cinerea. Cada barra representa el diámetro medio (± sd) de la lesión 5 días después de la inoculación (n = 6 plantas). P = 2,26 × 10−6, prueba t no apareada de dos colas. a – i, Los experimentos se repitieron tres veces independientes con resultados similares. b,f, Los valores exactos de P para todas las comparaciones se detallan en los datos de origen. c – e, g, consulte Datos de origen para recortar imágenes.

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Recientemente reunimos un SynCom eubiótico de 48 miembros (SynComCol-0) compuesto de bacterias endofíticas de hojas de plantas sanas de Arabidopsis Col-010. Para determinar hasta qué punto un SynCom eubiótico derivado de la endosfera de la hoja podría restaurar la inmunocompetencia de las plantas AX, comparamos los fenotipos PTI de plantas Col-0 cultivadas con y sin SynCom (SynComCol-0 vs MgCl2). Como control se utilizaron plantas Col-0 cultivadas con la microbiota derivada del suelo 'MSU'. Observamos una producción robusta de ROS inducida por flg22 en plantas de HO inoculadas con la microbiota derivada del suelo 'MSU' y plantas inoculadas con SynComCol-0 (Fig. 4a y Datos ampliados Fig. 5a). Luego cuantificamos la expresión del gen FRK1 inducida por flg22 y observamos que las plantas colonizadas por SynComCol-0 se restauraron en la expresión de FRK1 basal e inducida por flg22 (Fig. 4b, c), que nuevamente fue similar a la observada para las plantas HO (Fig. 1d ,mi). Además, las plantas colonizadas por SynComCol-0 tenían un mayor nivel de proteína BAK1 (Datos ampliados, Fig. 5b) y eran más resistentes a la infección por Pst DC3000 (Fig. 4d) en comparación con las plantas AX inoculadas de forma simulada con el mismo volumen de 10 mM. MgCl2. En conjunto, estos resultados sugieren que un SynCom bacteriano derivado de la endosfera foliar puede restaurar sustancialmente la competencia inmune de las plantas AX de manera similar a una microbiota natural derivada del suelo.

a, dinámica de explosión de ROS inducida por flg22 100 nM en plantas axénicas inoculadas de forma simulada con MgCl2 10 mM y plantas colonizadas por H2O o SynComCol-0. Los resultados representan la media ± sem (n = 12 plantas). b, c, expresión de FRK1 basal (b) y flg22 (c) en plantas inoculadas simuladamente con MgCl2 axénico y plantas inoculadas con SynComCol-0. El ARN total se extrajo 3 h después del tratamiento con una solución simulada que carecía de flg22 (b) o flg22 100 nM (c). Resultados relativos a la expresión basal en plantas inoculadas con SynComCol-0. Se utilizó PP2AA3 para la normalización. Las barras representan el valor de expresión medio (± sd) (n = 3 plantas). Expresión basal P = 0,0011; P = 0,0006 inducida por flg22, prueba t no apareada de dos colas. d, Poblaciones de Pst DC3000 en plantas axénicas inoculadas de forma simulada con MgCl2 10 mM y plantas inoculadas con SynComCol-0. Cada barra representa el título bacteriano medio (± sd) 3 días después de la inoculación como ufc cm-2 transformadas logarítmicamente (n = 4 plantas). P = 4,80 × 10−5, prueba t no apareada de dos colas. a – d, Los experimentos se repitieron tres veces independientes con resultados similares.

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Para evaluar la posible redundancia de miembros de SynComCol-0 en contribución a la competencia inmune, ensamblamos una versión simplificada de SynComCol-0 con solo 19 cepas (SynComCol-mix19) para cubrir la diversidad taxonómica a nivel de género (Datos complementarios 3). Descubrimos que SynComCol-mix19 podría restaurar eficazmente la producción de ROS en respuesta a flg22 (Datos ampliados, figura 6). Además, entre las cepas con alta representación en SynComCol-0, elegimos al azar una mezcla de tres cepas que están presentes en SynComCol-mix19 y descubrimos que estas tres cepas (SynComCol-mix3, que representan los géneros Achromobacter, Comamonas y Stenotrophomonas) también restauraron parcialmente las ROS. producción en respuesta a flg22 (Datos ampliados, figura 6). Esto sugiere que podría haber una redundancia significativa entre las cepas de SynComCol-0 que pueden dotar de inmunocompetencia.

Durante el desarrollo y optimización del sistema gnotobiótico a base de turba, notamos una correlación entre los niveles de restauración de la competencia inmune mediada por la microbiota y las concentraciones de los medios nutrientes Linsmaier y Skoog47 (LS) (que contienen sales minerales y algunos compuestos orgánicos como como mioinositol y tampón MES; consulte Métodos para el contenido de nutrientes) agregados durante la preparación del sistema gnotobiótico. Para determinar sistemáticamente los efectos de los nutrientes sobre la inmunocompetencia mediada por la microbiota, medimos la producción de ROS inducida por flg22 en plantas AX y HO a lo largo de un gradiente de concentración de nutrientes. Utilizando el mismo volumen de líquido, se prepararon GnotoPots con LS sin diluir (1x), LS con la mitad de su concentración (0,5x) y un décimo de su concentración (0,1x). Observamos un impacto significativo de los nutrientes en la producción de ROS mediada por flg22 en plantas de HO. La disminución de la potencia de los nutrientes aumentó significativamente la magnitud del estallido de ROS y acortó el tiempo para alcanzar la producción máxima de ROS (Fig. 5a) en plantas de HO. En niveles intermedios de nutrientes (0,5x LS), la magnitud del estallido de ROS aumentó moderadamente y el tiempo para alcanzar el máximo se redujo en comparación con concentraciones de nutrientes más altas (1x LS), pero el total de ROS producido no fue significativamente diferente (Fig. 5a y Datos ampliados). Figura 7a). En niveles bajos de nutrientes (0,1x LS), la magnitud del estallido de ROS aumentó, el tiempo hasta el máximo se acortó y el ROS total aumentó (Fig. 5a y Datos ampliados, Fig. 7a). La concentración de nutrientes no tuvo ningún efecto en el momento de la producción de ROS en las plantas AX, y sólo se observó un impacto marginal en la producción total de ROS. A continuación, examinamos los efectos de los componentes individuales del medio LS, incluidos nitrógeno, fósforo y hierro, así como compuestos que contienen carbono, mioinositol y MES, sobre la inmunocompetencia mediada por la microbiota suplementando 0,5x LS con cada nutriente/compuesto en la concentración presente. en 1xLS. Solo 1x nitrógeno (suministrado como sales NH4NO3 y KNO3) suprimió la producción de ROS inducida por flg22 y la expresión del gen FRK1 en plantas HO a niveles similares a 1x LS (Datos ampliados, Fig. 7b-d), lo que indica que el alto contenido de N juega un papel importante en suprimir la inmunocompetencia mediada por la microbiota.

a, dinámica de explosión de ROS inducida por flg22 100 nM en plantas AX y HO cultivadas en GnotoPots suministradas con concentraciones de solución nutritiva LS de 0,1x, 0,5x o 1x. Los resultados representan la media ± sem (n = 6 plantas). b, Abundancia absoluta de poblaciones bacterianas de la filosfera asociadas con plantas de HO cultivadas en GnotoPots suministradas con solución nutritiva de LS 0,5x o 1x. Cada barra representa el título bacteriano medio (± sd) como ufc cm-2 transformado logarítmicamente (n = 12 plantas). P = 6,20 × 10−5, prueba t no apareada de dos colas. a,b, Los experimentos se repitieron un mínimo de dos veces independientes con resultados similares. c, PCoA de distancias UniFrac ponderadas obtenidas a partir de perfiles de secuencia del gen 16S rRNA de la microbiota de entrada derivada del suelo (MSU) y la microbiota de la filosfera de plantas HO después de 6 semanas de crecimiento en GnotoPots suministrados con solución nutritiva 0,5x o 1x LS (0,5x LS vs 1x LS: q = 0,002, 0,5x LS vs entrada: q = 0,002, 1x LS vs entrada: q = 0,002; ANOVA multivariado permutacional por pares con 999 permutaciones). d, Abundancia relativa de poblaciones bacterianas a nivel de filo. Los miembros del filo Proteobacteria se separan en clases y los miembros de la clase Gammaproteobacteria se separan en orden. c,d, n = 5 muestras de suelo biológicamente independientes (entrada), n = 12 plantas (0,5x LS), n = 12 plantas (1x LS).

Datos fuente

Para determinar si la colonización microbiana se ve afectada por el nivel de nutrientes, determinamos la abundancia absoluta y relativa de la microbiota bacteriana de la filosfera mediante la enumeración de bacterias cultivables y la secuenciación del amplicón del gen ribosómico (r) 16S en plantas suplementadas con 0,5x LS o 1x LS. Las plantas cultivadas con 1x LS albergaban niveles de microbiota de bacterias de la filosfera total aproximadamente 10 veces más bajos en comparación con las plantas cultivadas con 0,5x LS (Fig. 5b). El análisis de coordenadas principales (PCoA) en distancias ponderadas de UniFrac indicó una diferencia de composición significativa entre las comunidades bacterianas de la filosfera asociadas con plantas cultivadas bajo los dos niveles de nutrientes (Fig. 5c). Se observó que Actinobacteriota, Bacteroidota y Gammaproteobactera (pertenecientes al orden Pseudomonadales) eran más abundantes en la filosfera de las plantas cultivadas con 0,5x LS, mientras que su abundancia relativa se redujo considerablemente en las plantas cultivadas con 1x LS. Por el contrario, las gammaproteobacterias pertenecientes al orden Burkholderiales aumentaron en abundancia relativa en plantas cultivadas con 1x LS en comparación con aquellas cultivadas con 0,5x LS (Fig. 5d). En conjunto, estos hallazgos ilustran una interacción tripartita entre la inmunidad, la microbiota y el medio ambiente durante la maduración mediada por la microbiota de la inmunidad desencadenada por flg22.

Varios informes recientes han comenzado a mostrar una contribución importante de la inmunidad de las plantas, incluida la PTI y las vías de tráfico vesicular, para mantener la homeostasis de la microbiota en las hojas de Arabidopsis1,10,11. En particular, pudimos establecer dos SynComs bacterianos derivados de la endosfera foliar paralelos: SynComCol-0 de 48 miembros derivado de hojas Col-0 sanas y SynCommfec de 52 miembros derivado de hojas mutantes mfec disbióticas10. Para investigar el impacto de una microbiota normal (eubiótica) frente a una microbiota disbiótica en la inmunidad de las plantas, examinamos la expresión de varios genes marcadores asociados a la inmunidad (FRK1, PR1 y CYP71A12) en plantas colonizadas con SynCommfec o SynComCol-0 en comparación con AX. Plantas en un sistema gnotobiótico basado en placas. Encontramos un gradiente de expresión de estos genes, con la expresión más alta observada en plantas Col-0 colonizadas por SynCommfec, un nivel intermedio en plantas colonizadas con SynComCol-0 y el nivel más bajo en plantas AX (Fig. 6a-c).

a – c, Expresión basal de genes relacionados con la defensa FRK1 (a), CYP71A12 (b) y PR1 (c) en plantas inoculadas con AX, SynComCol-0 y SynCommfec cultivadas en placas de agar. Se utilizó PP2AA3 para la normalización. Las barras representan la media ± sd (n = 4 muestras de plantas biológicamente independientes). Letras diferentes representan una diferencia significativa (P <0,05, ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc HSD de Tukey). d, Gráfico de volcán de genes expresados ​​diferencialmente en plantas colonizadas con SynComCol-0 y SynCommfec. Las regiones coloreadas representan una expresión diferencial significativa con |log2FC| > 1 y FDR < 0,05 (prueba de Wald corregida por Benjamin-Hochberg), con el número de genes correspondientes a cada grupo indicado entre paréntesis. e, enriquecimiento del término GO para DEG regulados positivamente en plantas colonizadas con SynCommfec en comparación con plantas colonizadas con SynComCol-0, clasificados por importancia (FDR <0,05 de corte). f, Mapa de calor para genes seleccionados del agrupamiento jerárquico de todos los DEG. Las descripciones de los genes se enumeran en los Datos complementarios 4. d – f, n = 3 muestras de plantas biológicamente independientes por condición.

Datos fuente

Para comprender mejor las respuestas transcripcionales de las plantas a la microbiota eubiótica frente a una microbiota disbiótica, realizamos un análisis de secuencia de ARN de plantas Col-0 colonizadas por SynCommfec y SynComCol-0 cultivadas en paralelo en el sistema GnotoPot. La colonización con SynComCol-0 en comparación con SynCommfec resultó en 774 DEG (| log2FC | > 1 y FDR <0.05) (Fig. 6d y Datos complementarios 4). El análisis de los términos GO de los 609 DEG regulados positivamente tras la colonización con SynCommfec frente a SynComCol-0 mostró una representación excesiva de los términos GO asociados con el estrés biótico y la inmunidad (Fig. 6e y Datos complementarios 5). Además, se regularon positivamente varias vías de inmunidad, incluida la resistencia sistémica adquirida, la señalización de PTI y los procesos biosintéticos de glucosinolato. Un análisis más detallado mostró que varios genes asociados a la disbiosis estaban involucrados en procesos relacionados con la patogénesis durante el estrés biótico, que están asociados con la inmunidad, la muerte celular y su regulación (Fig. 6f). En conjunto, nuestros resultados mostraron que el disbiótico SynCommfec sobreestimula la expresión de genes inmunes en comparación con el eubiótico SynComCol-0.

A continuación, examinamos la capacidad de los miembros individuales de SynCom para potenciar la estimulación inmune. Para facilitar el análisis de la expresión de genes inmunes que involucran una gran cantidad de cepas de microbiota (48 cepas SynComCol-0 y 52 cepas SynCommfec), primero realizamos ensayos cualitativos de β-glucuronidasa (GUS) con plántulas de 12 días de CYP71A12Pro:GUS. línea reportera cultivada en medio líquido LS inoculado con cada uno de los 100 miembros individuales del SynCom. Encontramos que las cepas de Stenotrophomonas maltophilia de SynComCol-0 (4 cepas) y SynCommfec (8 cepas) indujeron el reportero CYP71A12Pro:GUS en las hojas. Además, otras 4 cepas que son exclusivas de SynCommfec, incluidas Stenotrophomonas acidaminiphila (mfec-41), Stenotrophomonas sp. (mfec-48), Microbacterium sp. (mfec-31) y Pseudomonas citronellolis (mfec-34), mostraron actividad informadora CYP71A12Pro:GUS en hojas de plántulas (Datos ampliados, Fig. 8). Por tanto, SynCommfec tiene un mayor número y una mayor diversidad de cepas que pueden inducir la actividad del promotor CYP71A12 en las hojas. Luego realizamos un análisis independiente basado en RT-qPCR de la expresión del gen CYP71A12 en hojas de plantas de Arabidopsis Col-0 cultivadas en el suelo de 5 semanas de edad, revelando un patrón de expresión del gen CYP71A12 similar al del ensayo CYP71A12Pro:GUS reporter. , a pesar de condiciones de crecimiento de plantas muy diferentes en estos dos experimentos independientes (Datos complementarios 6). En particular, se demostró previamente que la mayoría de los miembros del SynCom inducidos por CYP71A12 causaban síntomas disbióticos10.

Aquí mostramos que las plantas de Arabidopsis cultivadas sin exposición a una microbiota están muy comprometidas en la inmunidad dependiente de la edad que ocurre en plantas colonizadas naturalmente por microbiota. Las plantas cultivadas axénicamente exhiben defectos significativos en PTI y son hipersusceptibles a la infección por el patógeno bacteriano Pst DC3000 y el patógeno fúngico B. cinerea. También mostramos que la inmunocompetencia puede restaurarse mediante la microbiota natural derivada del suelo, así como mediante una comunidad sintética bacteriana eubiótica de 48 miembros (SynComCol-0) derivada de bacterias endófitas de las hojas. Por el contrario, una comunidad sintética disbiótica de 52 miembros derivada de bacterias endofíticas de las hojas sobreestimula la expresión de genes inmunes. Finalmente, nuestros resultados muestran que la función de modulación inmune de la microbiota puede verse influenciada por las condiciones ambientales. En conjunto, estos resultados tienen implicaciones notables en la formulación de un marco para explicar la inmunidad dependiente de la edad, la interacción microbiota-inmunidad y las interacciones tritróficas "inmunidad-microbioma-ambiente" en las plantas.

Con respecto a la inmunidad dependiente de la edad, un estudio previo caracterizó la ontogenia de la inmunidad desencadenada por flg22 en plántulas muy jóvenes de Arabidopsis (dentro de los 6 días posteriores a la germinación) en placas de agar nutritivo axénico44,48, lo que proporcionó información sobre la maduración inmediata de las respuestas inmunes controlada por el desarrollo. después de la germinación. Sin embargo, los resultados presentados aquí muestran que la inmunidad desencadenada por flg22 exhibe un período de maduración dependiente de la edad que se extiende durante al menos las primeras 2 a 3 semanas de crecimiento vegetativo y que la maduración inmune dependiente de la edad a gran escala requiere exposición a la microbiota. Como se demuestra aquí, las plantas de HO colonizadas con microbiota en sistemas gnotobióticos a base de turba desarrollaron PTI dependiente de la edad con el tiempo, reflejando las plantas cultivadas convencionalmente en tierra para macetas. Por el contrario, el desarrollo de PTI dependiente de la edad se redujo considerablemente en las plantas AX. La maduración dependiente de la edad mediada por la microbiota guarda paralelos conceptuales sorprendentes con la observada en ratones libres de gérmenes en los que se reconoce bien una contribución importante de la microbiota endógena en la maduración posnatal de la inmunidad innata de los mamíferos38,39. Si bien generalmente se ha propuesto que la ARR es causada por procesos de desarrollo que antagonizan las respuestas inmunes45, los resultados presentados aquí revelaron que la maduración inmune asistida por la microbiota es un contribuyente no reconocido previamente que desempeña un papel importante en la maduración inmune dependiente de la edad en las plantas.

Cabe señalar que el descubrimiento de un papel causal de la microbiota en la maduración inmune dependiente de la edad requirió el uso de un sistema gnotobiótico capaz de cultivar plantas con o sin una comunidad de microbios naturales o sintéticas. Debido a que las placas de agar, un sistema gnotobiótico comúnmente utilizado, no son ideales para la colonización natural de plantas por una comunidad microbiana compleja debido al crecimiento excesivo artificial de algunos microbios, esto se logró en este estudio utilizando sistemas gnotobióticos FlowPot y GnotoPot con base de turba. sustrato, que simula parcialmente el sustrato natural del suelo. Usamos FlowPots y GnotoPots indistintamente y se repitieron algunos experimentos iniciales usando ambos sistemas con resultados similares. Para la mayoría de los experimentos posteriores, utilizamos GnotoPots porque permitieron que las plantas crecieran durante más tiempo en comparación con FlowPots43. Un descubrimiento importante durante este estudio es que los sistemas gnotobióticos de plantas a base de turba se pueden ajustar para simular una variedad de condiciones abióticas diversas, como los nutrientes. Esto fue útil para nuestro estudio porque muchas de las funciones de la microbiota en la naturaleza parecen depender del contexto. Por ejemplo, se ha demostrado que los regímenes de fertilizantes con alto contenido de nitrógeno aumentan la susceptibilidad de las plantas cultivadas en un sistema hidropónico no estéril49. Sin embargo, no se sabía si el efecto de los nutrientes ricos en nitrógeno está mediado en parte por la microbiota. En este estudio, el ajuste de las condiciones nutricionales de GnotoPots nos permitió descubrir que la supresión inmune mediada por nutrientes era más obvia en presencia de microbiota y que el alto contenido de nitrógeno tiene un efecto destacado en el nivel y la composición de la microbiota, lo que sugiere una interacción intrincada entre las plantas. , microbiota y condiciones nutricionales.

Estudios recientes comenzaron a ilustrar la importancia de las interacciones entre inmunidad y microbioma en las plantas. Por ejemplo, nosotros y otros hemos demostrado recientemente que los PRR asociados a PTI y los RBOHD/F generadores de ROS son componentes esenciales de una red genética vegetal en la configuración de una microbiota foliar eubiótica normal para prevenir la disbiosis perjudicial para la salud1,10,11. De manera similar, los miembros bacterianos de la microbiota de las hojas y las raíces estimulan o suprimen la expresión génica asociada a PTI50,51. En este estudio, encontramos que una comunidad sintética compuesta por 48 bacterias cultivables de la filosfera de Arabidopsis (SynComCol-0) fue suficiente para restaurar la inmunocompetencia en las hojas de las plantas AX a un nivel similar al conferido por una comunidad microbiana natural derivada del suelo. Esto es interesante teniendo en cuenta que la mayoría de los miembros de la microbiota bacteriana de las hojas viven en las superficies y menos del 5% de las bacterias de las hojas residen en el interior de las hojas10. Los resultados presentados aquí sugieren la importancia de las bacterias endofíticas de las hojas en la maduración de las respuestas inmunes en las hojas de Arabidopsis o la presencia de múltiples subcomunidades funcionalmente redundantes de cualquier microbiota determinada, con cada subcomunidad capaz de conferir de forma independiente la maduración inmune a las plantas. En cualquier escenario, parece haber una redundancia sustancial entre las diferentes cepas de la filosfera a la hora de dotar de inmunocompetencia (Datos ampliados, figura 6).

El papel de la microbiota en la modulación de la inmunocompetencia parece sólido en las diferentes condiciones de crecimiento de las plantas utilizadas en nuestro estudio. Cuando analizamos los perfiles de transcriptoma de plantas colonizadas por SynComCol-0 versus microbiota natural (HOMalaka o HOMSU), en comparación con las correspondientes plantas axénicas, se observó enriquecimiento de genes inmunes asociados en ambos casos (Datos ampliados, Fig. 9), aunque Las plantas se cultivaron en diferentes condiciones, incluidas diferentes mezclas de sustrato de crecimiento y fotoperíodos (ver Métodos). Curiosamente, los genes inmunes enriquecidos observados en nuestro estudio incluyen 20 genes de los llamados genes de "respuesta general no propia (GNSR)" que comúnmente son inducidos por 13 cepas individuales de la colección At-LSPHERE52. Los genes GNSR constituyen el 9% de los genes regulados positivamente (20/213) comúnmente enriquecidos en plantas inoculadas con microbiotas naturales y SynComCol-0 en este estudio. En general, nuestro estudio es consistente con la existencia de una respuesta transcriptómica central más amplia asociada a la microbiota y resalta la importancia de una comunidad natural o eubiótica en la configuración del panorama transcriptómico de las respuestas inmunes basales en las plantas.

Otra implicación importante de los hallazgos de este estudio es que las plantas de Arabidopsis no sólo requieren una microbiota para desarrollar adecuadamente PTI, sino que también la composición de la microbiota es importante. Descubrimos que SynComCol-0, una microbiota eubiótica derivada de hojas sanas de Arabidopsis, era suficiente para restaurar la inmunocompetencia de las plantas AX. Por el contrario, SynCommfec, una microbiota disbiótica derivada de hojas del cuádruple mutante Arabidopsis mfec, sobreestimuló la expresión de genes inmunes (Fig. 6). Esta observación sugiere que es necesaria una microbiota eubiótica saludable para controlar adecuadamente el sistema inmunológico de la planta. Creemos que esta es una observación importante porque en las interacciones entre humanos y microbiomas, la disbiosis se asocia con enfermedades autoinmunes como la enfermedad inflamatoria intestinal, diabetes, alergias y otros problemas de salud53,54. Por lo tanto, una interacción íntima entre inmunidad y microbiota parece ser fundamental para las interacciones huésped-microbioma tanto en el reino animal como en el vegetal. Las desviaciones de una microbiota eubiótica podrían provocar inmunodeficiencia (como en el caso de las plantas AX) o sobreestimulación inmune (como en el caso de las plantas inoculadas con SynCommfec). Por lo tanto, una microbiota eubiótica tiene un papel fundamental en la activación de la respuesta inmune de las plantas durante el crecimiento y el desarrollo.

En este estudio se utilizaron los siguientes genotipos de Arabidopsis thaliana: Col-0, bak1-5 bkk1-1 cerk1 mutante (bbc) (ref. 46). Las plantas cultivadas de forma convencional se cultivaron utilizando tierra para macetas compuesta de partes iguales de Suremix (Michigan Grower Products), vermiculita media y perlita. La tierra para macetas resultante se esterilizó en autoclave una vez para eliminar las plagas. Las plantas se cultivaron en una cámara de crecimiento con circulación de aire con las siguientes condiciones: 60 % de humedad relativa, 22 °C, ciclo de fotoperiodo de 12 h de día/12 h de noche, flujo de fotones diurno de ~90–100 μmol m-2 s-1 y suplementación con solución nutritiva 0,5x Hoagland55 según sea necesario.

Para experimentos que utilizaron sistemas gnotobióticos a base de turba43, las plantas se cultivaron en FlowPots o GnotoPots. Los nutrientes se complementaron con medio líquido LS tamponado 0,5x (pH 5,7) (Caisson Labs), a menos que se indique lo contrario. El LS sin diluir contiene 1900 mg l-1 KNO3, 1650 mg l-1 NH4NO3, 332,2 mg l-1 CaCl2, 200 mg l-1 tampón MES, 180,7 mg l-1 MgSO4, 170 mg l-1 KH2PO4, 100 mg l −1 mioinositol, 98 mg l−1 KHCO3, 37,26 mg l−1 EDTA, 27,8 mg l−1 FeSO4 ⋅ 7H2O, 16,9 mg l−1 MnSO4 ⋅ H2O, 8,6 mg l−1 ZnSO4 ⋅ 7H2O, 6,2 mg l −1 H3BO3, 0,83 mg l−1 KI, 0,4 mg l−1 tiamina HCl, 0,25 mg l−1 Na2MoO4 ⋅ 2H2O, 0,025 mg l−1 CoCl2 ⋅ 6H2O y 0,025 mg l−1 CuSO4 ⋅ 5H2O. El suelo para la inoculación de microbiota natural se recogió de una parcela de Miscanthus en la Universidad Estatal de Michigan (42,716989° N, 84,462711° W; entrada de microbiota 'MSU'). Para el experimento del transcriptoma utilizando comunidades HO, se obtuvo una segunda entrada de microbiota natural del suelo recolectado de un pastizal no perturbado en Malaka Township, Iowa (41.836100° N, 93.007800° W; entrada de microbiota 'Malaka'). Para los experimentos de microbiota de la comunidad natural, las plantas AX se inocularon simuladamente con una suspensión de suelo esterilizada en autoclave (50 g de suelo por litro de agua) y las plantas HO se inocularon con la misma suspensión de suelo no esterilizada en autoclave. Para experimentos que utilizaron comunidades sintéticas, las plantas se inocularon como se describió anteriormente10. Brevemente, los miembros individuales de la microbiota se cultivaron individualmente en placas individuales R2A (Sigma, 17209) antes de combinarlos en proporciones iguales (densidad óptica (OD) 600) en MgCl2 10 mM. Para los ensayos de GnotoPot, las suspensiones bacterianas se ajustaron a una DO600 final = 0,04 (~2 × 107 unidades formadoras de colonias (ufc) ml-1) y se usó 1 ml para inocular cada GnotoPot. Para los ensayos en placa, se aplicaron 2 µl de suspensión bacteriana con una DO600 final = 0,01 (~5 × 106 ufc ml-1) directamente sobre las semillas. Se inocularon de forma simulada plantas AX para experimentos comunitarios sintéticos con un volumen igual de MgCl2 10 mM.

Para los ensayos de protección de flg22 con Arabidopsis cultivada en tierra para macetas convencional, se infiltraron manualmente plantas de las edades indicadas utilizando una jeringa de extremo romo con flg22 500 nM y se dejaron secar hasta que ya no tuvieran una apariencia empapada de agua. Entre 16 y 24 h después del tratamiento previo con flg22, las hojas se infiltraron con 5 × 107 ufc ml-1 Pst DC3000 utilizando una jeringa con extremo romo. Las plantas infectadas se cubrieron parcialmente con una cúpula de plástico transparente para aumentar la humedad. Las poblaciones bacterianas se determinaron 24 h después de la infiltración.

Para los ensayos de protección de flg22 en Arabidopsis gnotobiótica, las plantas se cultivaron en FlowPots con 0,5x LS. Las fechas de siembra se escalonaron y las plantas de las edades indicadas se trataron al mismo tiempo para permitir una comparación directa. Las plantas se trataron previamente con flg22 100 nM usando una jeringa de extremo romo y se dejaron secar hasta que ya no tuvieran una apariencia empapada de agua. Las plantas de control y tratadas con flg22 se mantuvieron en microcajas con la tapa puesta durante la noche. 24 h después del pretratamiento con flg22, las plantas se infiltraron con una jeringa con Pst DC3000 a 1 × 106 ufc ml-1. Se dejó que las plantas infectadas se secaran hasta que ya no tuvieran una apariencia empapada de agua y luego se cubrieron con una cúpula de plástico transparente para mantener una humedad alta. Las poblaciones bacterianas se determinaron 24 h después de la infiltración.

Para los ensayos de enfermedades (sin pretratamiento con flg22) en Arabidopsis gnotobiótica, las plantas se cultivaron en FlowPots o GnotoPots con 0,5x LS y se infiltraron manualmente con Pst DC3000 a 1 × 105 ufc ml-1. Las plantas infectadas se dejaron secar y luego se mantuvieron a alta humedad (>95% de humedad relativa). Las poblaciones bacterianas se determinaron 3 días después de la infiltración. Para la inoculación de B. cinerea, las esporas se diluyeron en caldo de maltosa Sabouraud al 1% (BD, 242910) hasta una concentración final de 1 x 105 esporas por ml. Se detectaron dos gotitas de 2 µl por hoja en tres hojas por planta. Las plantas infectadas se mantuvieron a alta humedad (>95% de humedad relativa). Se tomaron imágenes de las lesiones 5 días después de la inoculación y se cuantificaron utilizando ImageJ v.1.51.

Para los experimentos de transcriptoma con aportes de la comunidad natural, el ARN total se extrajo de rosetas enteras de Arabidopsis cultivadas en FlowPot inoculadas con microbiota de aporte derivada del suelo 'MSU' o 'Malaka' o, en el caso de plantas AX, inoculadas de forma simulada con un aporte correspondiente. microbiota que había sido esterilizada en autoclave. Una réplica biológica se define como un conjunto de ocho rosetas recolectadas de cuatro FlowPots dentro de la misma microcaja. Se recolectaron tres réplicas biológicas por condición, con un total de seis réplicas holoxénicas y seis axénicas. El ARN se extrajo utilizando el kit RNeasy Plant Mini (Qiagen, 74904) según el protocolo del fabricante, con digestión con ADNasa en columna opcional. El ARN purificado se eluyó en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM). Las concentraciones de ARN se determinaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific) o mediante un ensayo fluorométrico Qubit RNA HS (Thermo Fisher, Q32855). Las muestras de ARN total se recogieron en tubos LoBind de ácido nucleico de 2,0 ml (Eppendorf, 022431048) y se almacenaron a -80 °C. Se verificó la calidad del ARN utilizando un Bioanalyzer 2100 (Agilent) y se determinó que todas las muestras tenían una puntuación de integridad de ARN de seis o más. Las bibliotecas de secuenciación hebrada se prepararon utilizando el sistema NuGEN Ovation RNA-SEQ para organismos modelo (Arabidopsis) de acuerdo con el protocolo del fabricante (NuGEN). La preparación y secuenciación de la biblioteca fueron realizadas por el Centro de Servicios de Tecnología de Investigación de la Universidad Estatal de Michigan (RTSF). La secuenciación se realizó en HiSeq 2500 (Illumina) con un formato monocatenario de lectura única de 1 × 50 pb utilizando reactivos Illumina HiSeq SBS (v.4). La llamada base se realizó utilizando Illumina Real Time Analysis (RTA) v.1.18.64.

Para los experimentos de transcriptoma con SynComs, las plantas se cultivaron en GnotoPots en condiciones de día largo (16 h de día/8 h de noche) y se tomaron muestras el día 26 después de la germinación. En el momento de la cosecha, se combinaron dos hojas de una sola planta por muestra y se recogieron un total de tres muestras de plantas biológicamente independientes por condición. La extracción de ARN se realizó como se describe anteriormente, pero las muestras se eluyeron en agua libre de RNasa/DNasa. Los controles de calidad del ARN se realizaron utilizando Qubit (Thermo Fisher) y TapeStation (Agilent). Las bibliotecas de RNA-seq se agruparon y secuenciaron en Illumina NovaSeq 6000 S1 para obtener lecturas de extremos emparejados de 50 pb. La llamada de base se realizó utilizando Illumina RTA 3. La preparación de la biblioteca y la secuenciación fueron realizadas por el Centro de Tecnologías Genómicas y de Secuenciación del Centro de Biología Genómica y Computacional de la Universidad de Duke.

Las lecturas del transcriptoma sin procesar para ambos experimentos del transcriptoma se procesaron en Duke Compute Cluster de la siguiente manera: el control de calidad de la lectura se realizó utilizando FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)56, recorte del adaptador y secuencia El mapeo se logró utilizando Trimmomatic57 y STAR (v.9.3.0) (ref. 58). La expresión génica se cuantificó utilizando el paquete R Rsubreads (v.2.8.2) (ref. 59). Los DEG se identificaron utilizando el paquete R DESeq2 (ref. 60). La transformación de lectura y la normalización para PCoA y agrupación se realizaron utilizando el paquete EdgeR en la plataforma iDEP (v.1.0) (ref. 61). Los genes con expresión diferencial se seleccionaron usando |log2FC| > 1 y FDR < 0,05 (calculado utilizando la configuración predeterminada de DESeq2 basada en la prueba de Wald corregida por Benjamini-Hochberg) como criterio de selección, y el análisis GO se realizó utilizando ShinyGO (v.0.76.2) (ref. 62) con un corte FDR. de 0,05 y 4 genes por criterio de selección de grupo.

Se tomaron discos de hojas (4 mm de diámetro) del centro de hojas de plantas de diversas edades y se hicieron flotar con el lado abaxial hacia abajo en pocillos de una placa blanca de 96 pocillos que contenía 200 µl de agua estéril en cada pocillo. Las placas se cubrieron con papel de aluminio y los discos de hojas se mantuvieron en agua esterilizada durante la noche para atenuar la respuesta a la herida. Después de 24 h, se eliminó el agua de los pocillos y se reemplazó con 100 μl de una solución inmunoestimulante que contenía 34 μg ml-1 de luminol (Sigma, A8511), 20 μg ml-1 de peroxidasa de rábano picante (Sigma, P6782) y 100–250 nM. del PAMP/DAMP indicado. Se recogieron mediciones de luminiscencia (recuento total de fotones) durante 40 minutos inmediatamente después de la adición de la solución inmunoactivadora utilizando un lector de microplacas SpectraMax L con SoftMax Pro v.7.0.3 (Molecular Devices). Se calculó el ROS total para cada muestra en Prism v.10.0.0 (GraphPad) utilizando el análisis de "Área bajo la curva".

Para el análisis RT-qPCR de la expresión génica inducida por elicitor, se rociaron plantas enteras o se hicieron flotar discos de hojas en una solución de inductor. Para la provocación por pulverización (Figs. 1d, e y 3f), las plantas de las edades indicadas se trataron con una pulverización foliar de una solución inductora que consistía en flg22 100 nM, dimetilsulfóxido al 0,1% y Silwet-L77 al 0,025% (Bioworld, 30630216), o un Solución simulada que carecía de flg22. Se aplicaron pulverizaciones foliares, asegurando que la solución de tratamiento entrara en contacto con los lados adaxial y abaxial de las hojas. Se recogió tejido aéreo para su posterior procesamiento. Para la obtención de discos foliares (Figs. 3b y 4c, y Datos ampliados, Fig. 7d), se tomaron discos foliares de 4 mm de plantas de 4,5 a 6 semanas de edad y se hicieron flotar en agua esterilizada durante la noche. Al día siguiente, se eliminó el agua y se reemplazó con una solución inductora que contenía 250 nM del PAMP/DAMP indicado. Para el análisis de la expresión genética basal de plantas cultivadas en placas (Fig. 6a-c), se cortaron rosetas completas de plántulas de 16 días y se transfirieron a tubos con tapa de rosca de 2 ml antes de congelarlas en N2 líquido y almacenarlas a -80 °. C hasta su posterior procesamiento. Se reunió el tejido aéreo de 5 plantas de una sola placa para constituir una réplica biológica. Para el análisis transcripcional de la infiltración de hojas de SynCom (Datos complementarios 6), se infiltraron manualmente plantas de 4,5 a 5 semanas de edad con cada cepa a una DO600 de 0,2 y se recolectaron tres réplicas biológicas después de 24 h para la extracción de ARN.

El ARN total se extrajo de los tejidos de las hojas usando Trizol (Thermo Fisher, 15596026) y un kit de extracción de ARN Direct-zol (Zymo Research, R2055) o un kit RNeasy Plant Mini (Qiagen, 74904) de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando el opcional on- Tratamiento con ADNasa en columna. La síntesis de ADN (c) complementaria se realizó en volúmenes de 10 μl con la mezcla maestra SuperScript IV VILO (Thermo Fisher, 11766500) o la transcriptasa inversa M-MLV (Thermo Fisher, 28025013) de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando 640–1000 ng de ARN total como entrada. Tras la síntesis, el ADNc se diluyó 10 veces y la qPCR se realizó por duplicado en un mínimo de tres réplicas biológicas en volúmenes de reacción de 10 µl que contenían 5 µl de la mezcla maestra de PCR SYBR Green (Applied Biosystems, 4309155), 0,25 µl de cada cebador y 2 µl. de ADNc molde. La qPCR se realizó en un sistema ABI 7500 Fast (Applied Biosystems) o QuantStudio 5 RT-qPCR (Applied Biosystems) y se analizó con el software SDS v.2.0 (Applied Biosystems) o el software Design and Analysis v.1.5.2 (Applied Biosystems). , respectivamente, utilizando la configuración predeterminada. Se utilizó PP2AA3 para la normalización. Los conjuntos de cebadores utilizados para cuantificar la expresión genética en este estudio se enumeran en los Datos complementarios 9.

Las hormonas vegetales SA y SAG se extrajeron como se describió anteriormente63. En resumen, se combinaron 2 o 3 hojas cosechadas de plantas de 4,5 semanas cultivadas en FlowPots, se pesaron, se congelaron y luego se molieron hasta obtener polvos finos con un TissueLyser (Qiagen). Los polvos congelados se resuspendieron en 1 ml de tampón de extracción que contenía 80 % de metanol, 0,1 % de ácido fórmico, 0,1 mg ml-1 de hidroxitolueno butilado y ácido abscísico deuterado 100 nM (ABA-2H6) en agua. Las muestras se extrajeron durante la noche a 4 °C con agitación suave. Al día siguiente, las muestras se aclararon mediante centrifugación a 12.000 × g durante 10 minutos, se filtraron a través de una membrana de PTFE de 0,2 μm (Millipore, UFC30LG25) y se transfirieron a viales de muestreador automático. Las inyecciones (10 µl) de extractos preparados se separaron utilizando una columna C18 de núcleo fundido Ascentis Express (2,1 x 50 m, 2,7 µm) calentada a 50 °C en un sistema de cromatografía líquida de ultra rendimiento Acquity (Waters Corporation). Se aplicó un gradiente de ácido fórmico al 0,15 % en agua (disolvente A) y metanol (disolvente B) durante 2,5 min a un caudal de 0,4 ml min-1. La separación consistió en un aumento lineal de A:B (49:1) a 100% B. Se monitorearon las transiciones de moléculas desprotonadas a iones de producto característicos para ABA-2H6 (m/z 269,1 > 159,1), SA (m/z 137,0 > 93,0) y SAG (m/z 299,1 > 137,0) en un espectrómetro de masas en tándem Quattro Premier (Waters Corporation) en modo de iones negativos. El voltaje del capilar, el voltaje del cono y el voltaje del extractor fueron 3500 V, 25 V y 5 V, respectivamente. Los caudales fueron 50 l h-1 para el gas de cono (N2) y 600 l h-1 para el gas de desolvatación (N2). ABA-2H6 sirvió como estándar interno para la cuantificación de hormonas. Se utilizó MassLynx v.4.1 (Waters) para la adquisición y procesamiento de datos. Las energías de colisión y los potenciales del cono fuente se optimizaron utilizando el paquete MassLynx v.4.1 QuanOptimize (Waters). Se integraron los picos y se cuantificaron los analitos basándose en curvas estándar normalizadas con respecto al estándar interno.

La proteína se extrajo de las hojas como se describió anteriormente19 con ligeras modificaciones. Primero, los tejidos de las hojas congeladas se trituraron hasta obtener polvos finos con un TissueLyser (Qiagen) utilizando dos ciclos de 45 s a 28 Hz. Los polvos se recogieron en un tampón de extracción de proteínas que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, glicerol al 10 % (v/v), IGEPAL CA-630 (NP-40) al 1 % (v/v) ( Sigma, I3021), desoxicolato de sodio al 0,5 % (p/v) y 1 tableta de inhibidor de proteasa completo sin EDTA (Roche, 11836170001) y se incubaron en hielo durante 15 minutos con inversión periódica. Los lisados ​​​​de hojas se eliminaron mediante centrifugación a 10.000 × g durante 5 minutos y la proteína total se normalizó mediante el ensayo de Bradford (Biorad, 5000006). Los extractos se prepararon para SDS-PAGE con un tampón de carga 5x que contenía dodecilsulfato de sodio al 10% (p/v), glicerol al 20%, Tris-HCl 0,2 M (pH 6,8) y azul de bromofenol al 0,05%, y se desnaturalizaron gradualmente en un termociclador usando la siguiente secuencia: 37 °C por 20 min, 50 °C por 15 min, 70 °C por 8 min y 95 °C por 5 min. Posteriormente, las proteínas se separaron en geles de bis-tris NuPAGE 4–12 % (Thermo Fisher, NP0321) durante 2,5 h usando 100 V. Luego, las proteínas se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno usando un sistema de transferencia en seco iBlot 2 (Thermo Fisher), se bloquearon en 3% de leche + 2% de BSA e inmunotransferencia durante la noche a 4 °C con anticuerpos específicos de Arabidopsis FLS2 (Agrisera, AS12 1857; dilución 1:5000), BAK1 (Agrisera, AS12 1858; dilución 1:5000), MPK3 (Sigma, M8318 ; dilución 1:500) o MPK6 (Sigma, A7104; dilución 1:2000) en las diluciones indicadas. Las transferencias para detectar MAPK fosforilada se bloquearon en BSA al 5 % y se inmunotransfirieron con un anticuerpo fósforo-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling, 9101; dilución 1:1000). Se usó un anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante producido en cabra (Agrisera, AS09 602; 1:40,000) como anticuerpo secundario y las proteínas de interés resultantes se visualizaron con un sustrato quimioluminiscente SuperSignal West (Thermo Fisher) en un sistema iBright 1500 ( Invitrogen). Se realizó tinción con Ponceau S o Amido Black para verificar la carga igual. Las bandas se cuantificaron utilizando ImageJ v.1.51.

Se utilizó un enfoque basado en cultivos para cuantificar las comunidades bacterianas de la filosfera como se describió anteriormente10. Brevemente, las hojas se enjuagaron dos veces con agua esterilizada y se secaron al aire para eliminar el agua superficial residual. Luego se pesaron las hojas y se molieron en MgCl2 10 mM y se sembró una dilución en serie en R2A (Sigma, 17209) suplementado con 50 μg ml-1 de cicloheximida. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 días, luego a 4 °C durante 4 días y se contaron las colonias.

Se utilizó la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA para estimar la abundancia relativa de taxones bacterianos. El ADN total se extrajo de la filosfera y de las comunidades de entrada utilizando el kit DNeasy PowerSoil Pro (Qiagen, 47014) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para muestras de filosfera, se combinaron de 2 a 3 hojas de una sola planta por muestra biológica (n = 12). Para las muestras de entrada, se guardaron 500 μl de lechada de suelo durante la inoculación (n = 5). La PCR se realizó con ADN polimerasa Taq de alta fidelidad AccuPrime (Thermo Fisher, 12346086) utilizando cebadores con código de barras con adaptadores de heterogeneidad dirigidos a la región v5/v6 del gen 16S rRNA (799F y 1193R, consulte los Datos complementarios 9 para ver las secuencias de cebadores). Los amplicones primarios se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1%. El ADN en la banda de ~ 400 pb se recuperó utilizando el kit Zymoclean Gel DNA Recovery (Zymo Research, D4008). La concentración del ADN recuperado se midió con un kit de ensayo de ADNds PicoGreen (Invitrogen, P7589) y se normalizó a 1–10 ng μl-1. Las muestras se enviaron al RTSF Genomics Core de la Universidad Estatal de Michigan para la preparación de la biblioteca y la secuenciación del gen 16S rRNA.

RTSF Genomics Core realizó una PCR secundaria utilizando cebadores compatibles con Illumina de doble índice que se dirigen a los oligómeros Fluidigm CS1/CS2 en los extremos de los productos de PCR primarios. Los amplicones se normalizaron por lotes utilizando placas de normalización de ADN SequalPrep (Invitrogen, A1051001) y se combinó el producto recuperado. La calidad de los grupos se controló y se cuantificó utilizando una combinación de ensayos Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher, Q32855), 4200 TapeStation HS DNA1000 (Agilent) y Collibri Library Quantification qPCR (Invitrogen, A38524100). El conjunto de bibliotecas se cargó en una celda de flujo MiSeq v2 y la secuenciación se realizó en un formato de extremos emparejados de 2 × 250 pb utilizando un cartucho de reactivos de 500 ciclos MiSeq v.2. Se agregaron cebadores de índice y secuenciación personalizados complementarios a los oligómeros Fluidigm CS1 y CS2 a los pocillos apropiados del cartucho de reactivo. La llamada base se realizó mediante Illumina RTA v.1.18.54 y la salida de RTA se demultiplexó y se convirtió al formato FastQ con Illumina Bcl2fastq v.2.20.0.

Los archivos fastq sin procesar del instrumento MiSeq se demultiplexaron y procesaron utilizando la distribución QIIME 2 Core 2022.264. En resumen, los cebadores y los espaciadores de heterogeneidad se eliminaron usando Cutadapt65 y se usó DADA2 (ref. 66) para recortar, filtrar la calidad y eliminar el ruido de las secuencias, eliminar secuencias quiméricas y obtener variantes de secuencia de amplicones. La asignación taxonómica de cada variante de secuencia de amplicón se realizó utilizando un clasificador Naïve Bayes67 previamente entrenado en la base de datos de referencia del gen rRNA SILVA 16S (versión 138) (ref. 68) formateada para QIIME usando el complemento RESCRIPt69. Se eliminaron las secuencias no asignadas o las secuencias identificadas como cloroplastos o mitocondrias de plantas. Los análisis de diversidad se realizaron dentro de QIIME 2. Las muestras se enrarificaron a 5765 lecturas para calcular las métricas de diversidad.

El ensayo GUS se realizó como se describió anteriormente70 con modificaciones menores. Brevemente, las plántulas se cultivaron en placas de 24 pocillos que contenían medio LS líquido suplementado con 0,5% de sacarosa en un ciclo de día/noche de 16 h/8 h en una cámara de crecimiento de plantas Percival a 22 °C con una intensidad de luz de 50 μmol m-2 s. −1. Las plantas fueron inoculadas el día 12 con cepas bacterianas. Las cepas bacterianas se cultivaron en placas R2A a 22 °C durante 3 días, se resuspendieron en MgCl2 10 mM y se agregaron a las plántulas en medio LS sin sacarosa a una DO600 de 0,002. Después del tratamiento con cepas SynCom durante 5 h, las plántulas se enjuagaron con 0,5 ml de tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7) y se sumergieron en 0,5 ml de solución de tinción GUS (fosfato de sodio 50 mM (pH 7), K4[Fe(CN) 0,5 mM). 6], K3[Fe(CN)6] 0,5 mM, X-Gluc 1 mM (GoldBio, G1281C) y Silwet-L77 0,01 % (Bioworld, 30630216)). Después de la infiltración al vacío durante 10 minutos, las placas se incubaron a 37 °C durante la noche. Las plantas se fijaron con una solución 3:1 de etanol:ácido acético a 4 °C durante 1 día y luego se transfirieron a etanol al 95%.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

La secuenciación sin procesar de RNA-seq y los datos analizados se han depositado en la base de datos NCBI Gene Expression Omnibus con el acceso GSE218961 y GSE218962. Las secuencias del gen 16S rRNA sin procesar de este proyecto están disponibles en la base de datos Sequence Read Archive en BioProject PRJNA977816, números de acceso SAMN35534885 a SAMN35534914. Las secuencias de referencia y la taxonomía del gen SILVA 16S rRNA compatible con QIIME (versión 138) se pueden descargar desde https://docs.qiime2.org/2022.2/data-resources/. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código utilizado para el análisis de datos sin procesar de RNA-seq se puede encontrar en https://github.com/rsohrabi/MIP_ms. El flujo de trabajo de análisis de secuencia completo para el análisis de amplicones 16S está disponible en https://github.com/BradCP/A-critical-role-of-a-eubiotic-microbiota-in-gating-proper-immunocompetence-in-Arabidopsis.

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Cheng, Z. y col. Las proteasas secretadas por patógenos activan una nueva vía inmune vegetal. Naturaleza 521, 213–216 (2015).

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Agradecemos a los estudiantes universitarios C. Griffin, T. Ulrich, F. Dion y T. Johnson, y al técnico de laboratorio D. Rhodes por su ayuda en el diseño y construcción de sistemas gnotobióticos y por realizar experimentos críticos que llevaron a estos resultados publicados; H. Jin por compartir B. cinerea; F. Ausubel por compartir las semillas de la línea CYP71A12Pro:GUS; y miembros del He Lab por la lectura crítica del manuscrito. YTC contó con el apoyo del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Naturales de Canadá.

Estos autores contribuyeron igualmente: Bradley C. Paasch, Reza Sohrabi, James M. Kremer.

Departamento de Biología, Universidad de Duke, Durham, Carolina del Norte, EE. UU.

Bradley C. Paasch, Reza Sohrabi, Kinya Nomura, Yu Ti Cheng y Sheng Yang He

Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de Duke, Durham, Carolina del Norte, EE. UU.

Bradley C. Paasch, Reza Sohrabi, Kinya Nomura, Yu Ti Cheng y Sheng Yang He

Laboratorio de Investigación de Plantas del Departamento de Energía, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, EE. UU.

James M. Kremer y Jennifer Martz

Departamento de Fitopatología, Universidad de Georgia, Atenas, GA, EE. UU.

Brian Kvitko

Departamento de Microbiología y Genética Molecular, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, EE. UU.

James M. Tiedje

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JMK, JMT y SYH conceptualizaron el proyecto inicial. BCP, RS, JMK, JMT y SYH diseñaron el estudio y analizaron los datos. BCP realizó ensayos de plantas gnotobióticas y análisis de 16S. RS realizó ensayos de plantas gnotobióticas y análisis de secuencias de ARN. JMK realizó RNA-seq en FlowPots y ensayos preliminares de plantas gnotobióticas. KN realizó ensayos temporales en plantas convencionales y gnotobióticas. YTC diseñó cebadores de PCR 16S con espaciadores de heterogeneidad y generó amplicones primarios. JM ayudó con ensayos gnotobióticos de nutrientes. BK realizó ensayos de protección temporal de flg22 en plantas cultivadas convencionalmente. BCP, RS y SYH escribieron el manuscrito con aportaciones de todos los autores.

Correspondencia a Sheng Yang He.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Plants agradece a Yang Bai, Steven Lindow y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Se trataron plantas HO de tipo salvaje (Col-0) de 4 semanas de edad (Col-0) y mutantes bbc 24 horas antes de la inoculación con Pst DC3000 (OD600 = 0,002) con agua (simulada) o con una solución de flg22 100 nM. Cada columna representa el título bacteriano medio 24 horas después de la inoculación como log transformado ufc/cm2 (n = 3 plantas). Las barras de error indican SD. (Col-0: p = 7,74 × 10-9, bbc: no significativo; ANOVA de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Šidák). Este experimento se repitió tres veces independientes con resultados similares. Los valores p exactos para todas las comparaciones se detallan en los datos de origen.

Datos fuente

Producción total de ROS inducida por flg22, elf18 y Pep1 250 nM en plantas AX y HO en GnotoPots. Resultados calculados a partir de los datos presentados en la Fig. 2a determinando el área media bajo la curva (n = 8 plantas). Las barras de error indican SD (flg22: p = 6,07 × 10-5, elf18: p = 3,77 × 10-5, Pep1: p = 0,03; ANOVA de dos vías con la prueba LSD de Fisher). Este experimento se repitió tres veces independientes con resultados similares.

Datos fuente

Proteína FLS2 total detectada en lisado de tejido de hoja entera de cuatro plantas agrupadas. Dos repeticiones experimentales muestran variabilidad en la abundancia relativa de FLS2. La tinción Ponceau S de todas las transferencias muestra una carga igual. Este experimento se repitió cinco veces con resultados variables. Se muestran transferencias de dos experimentos representativos. Consulte Datos de origen para recortar imágenes.

Datos fuente

a, b, Niveles totales de ácido salicílico (SA) (a) y SA glucosilado (b) en plantas AX y HO. Cada barra representa los valores medios (n = 6 muestras de plantas biológicamente independientes). Las barras de error representan SD (SA: p = 0,003, SAG: p = 0,002; prueba t no pareada de dos colas). Este experimento se repitió tres veces independientes con resultados similares.

Datos fuente

a, Producción total de ROS inducida por flg22 100 nM en plantas colonizadas por H2O o SynComCol-0. Resultados calculados a partir de los datos presentados en la Fig. 3a determinando el área media bajo la curva ± DE (n = 12 plantas). Letras diferentes representan una diferencia significativa (p <0,05, ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc HSD de Tukey). Los valores p exactos para todas las comparaciones se detallan en los datos de origen. b, Proteína BAK1 total detectada en lisados ​​de hojas de plantas de 6 semanas de edad inoculadas de forma simulada con MgCl2 10 mM y plantas colonizadas por SynComCol-0. Los números debajo de la transferencia indican la intensidad de la banda en relación con la de Ponceau S, normalizada a HO = 1,00. Consulte Datos de origen para recortar imágenes. a,b, Los experimentos se repitieron dos veces con resultados similares.

Datos fuente

a, cinética de explosión de ROS después de la inducción con flg22 250 nM en plantas colonizadas por SynComCol-mix19, SynComCol-mix3 o inoculadas simuladamente con MgCl2 10 mM como control en GnotoPots. Los resultados representan los valores medios ± sem (n = 8 plantas). b, Producción total de ROS calculada determinando el área bajo cada curva mostrada en el panel a. Los resultados representan el valor medio ± DE (n = 8 plantas). Letras diferentes representan una diferencia significativa (p <0,05, ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc HSD de Tukey). Los valores p exactos para todas las comparaciones se detallan en los datos de origen. Este experimento se repitió dos veces independientes con resultados similares.

Datos fuente

a, Producción total de ROS inducida por flg22 100 nM en plantas AX y HO cultivadas en GnotoPots suministradas con concentraciones de solución nutritiva LS de 0,1x, 0,5x o 1x. Resultados calculados a partir de los datos presentados en la Fig. 5a determinando el área media bajo la curva ± DE (n = 6 plantas). Letras diferentes representan una diferencia significativa (p < 0,05, ANOVA de dos factores con la prueba LSD de Fisher). este experimento fue repetido tres veces con resultados similares. b, dinámica de explosión de ROS inducida por flg22 250 nM en plantas de HO cultivadas en GnotoPots suministradas con 0,5x LS, 0,5x LS suplementado con componentes adicionales de LS hasta 1x y 1x LS. Plantas AX incluidas como control. Los resultados representan el valor medio ± sem (n = 8 plantas). c, Producción total de ROS calculada determinando el área bajo cada curva en el panel b. Los resultados representan el valor medio (n = 8 plantas). Las barras de error representan SD (en comparación con 0,5x LS: p = 0,0051 (+ N), p = 0,0009 (1x LS), q = 0,0184 (AX), todos los demás ns; ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett). d, expresión del gen FRK1 en plantas AX y HO inducida por flg22 250 nM. El ARN total se extrajo de los discos de las hojas 1,5 h después del tratamiento. Se utilizó PP2AA3 para la normalización. Las barras representan el valor medio (n = 8 plantas). Las barras de error indican SD (en comparación con 0,5x LS: p = 0,0180 (+ N), p = 0,0169 (1x LS), p = 0,0234 (AX), todos los demás ns; ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett). anuncio, Los experimentos se repitieron un mínimo de dos veces independientes con resultados similares. a,c,d. Los valores p exactos para todas las comparaciones se detallan en los datos de origen.

Datos fuente

La tinción histoquímica GUS se realizó después del tratamiento de plántulas de 12 días de CYP71A12pro: línea indicadora GUS con cepas SynCom individuales. Aquí se muestran imágenes representativas de plantas después del ensayo GUS. Este experimento se repitió dos veces independientes con resultados similares.

a. El diagrama de Venn de DEG regulados positivamente mostró 213 genes comunes de Arabidopsis en respuesta a la microbiota natural y la colonización SynComCol-0. Se identificaron DEG significativos utilizando DESEq2 con |log2FC | > 1 y FDR < 0,05 (Prueba de Wald corregida por Benjamin-Hochberg) en una comparación de plantas HO (colonizadas por comunidades microbianas de dos lugares/tipos de suelo diferentes, 'MSU' y 'Malaka') y plantas colonizadas con SynComCol-0 con sus correspondientes Control de hacha. b, Se muestra un subconjunto de genes regulados diferencialmente en plantas HO y SynComCol-0, en comparación con las plantas AX correspondientes. El mapa de calor de los DEG se generó mediante agrupación jerárquica con distancia euclidiana y vinculación completa. ce, análisis de enriquecimiento del término de ontología genética (GO) (proceso biológico GO:BP) en 213 DEG enriquecidos comunes tanto en HO como en SynComCol-0, solo en HO o solo en plantas SynComCol-0, en comparación con sus respectivas plantas de control AX. Se muestran los términos GO más enriquecidos, clasificados por importancia (FDR < límite de 0,05). Los 213 DEG enriquecidos comunes tanto en HO como en SynComCol-0 (panel c) mostraron el mayor enriquecimiento para los términos GO asociados a la inmunidad. Los genes GNSR presentes en el subconjunto de 213 DEG comunes tanto en HO como en SynComCol-0 están marcados en rojo en el panel b. ae, n = 3 muestras de plantas biológicamente independientes por condición.

Datos complementarios 1–10.

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Reimpresiones y permisos

Paasch, BC, Sohrabi, R., Kremer, JM et al. Un papel fundamental de una microbiota eubiótica para activar la inmunocompetencia adecuada en Arabidopsis. Nat. Plantas (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01501-1

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Recibido: 30 de noviembre de 2022

Aceptado: 27 de julio de 2023

Publicado: 17 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01501-1

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